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中药多糖在信号转导中诱导细胞凋亡的探讨

2010-07-30 12:47:03 作者：新特药房来源：中国新特药网天津分站浏览次数：55 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的研究中药多糖在信号转导中诱导细胞凋亡的作用并探讨其作用机制。方法培养1、8h后,经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖诱导S-180肉瘤细胞的凋亡,其效果与 ...

【摘要】
目的研究中药多糖在信号转导中诱导细胞凋亡的作用并探讨其作用机制。方法培养1、8h后,经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖诱导S-180肉瘤细胞的凋亡,其效果与茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖的浓度和作用时间有关。实验组培养液,分别加入茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖各100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL,培养1、8h后细胞凋亡率有增高趋势。实验组细胞凋亡率与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。结论中药多糖在早期能诱导细胞凋亡,在晚期能引起细胞坏死,抑制S-180肉瘤细胞的增殖。

【关键词】中药多糖;信号转导;肿瘤;细胞凋亡;流式细胞仪

Study of the Cell Apoptosis and Mechanism of Plant Polysaccharide in Cellular Signalling Pathway

FENG Gang,LUO Liqiong,KONG Qingzhi,HUANG Tao, LU Hongda

1.The Puai Hospital of Wuhan,Wuhan 430033,China;2.Traditional Chinese Medicine College of Hubei; 3.Wuhan Hygiene BureauAbstract：Objective To study the cell apoptosis and probe its under lying mechanism of plant polysaccharide in cellular signalling pathway.Methods After cultured for 1 and 8h, the cell apoptotic rate of mice sarcoma S-180 cell line was observed by flow cytometry.Results cell apoptosis of mice sarcoma S-180 cell line was induced by PB (polyporusum bellatus) PPS(pachyman polysaccharides) APS(astragalus polysaccharides) in doseand timedependent manners.After respectably treated with 100，250，500μg/mL of Plant polysaccharide for 1 and 8h.The cell apoptotic rate of mice sarcoma S-180 cell line were on the rise with time and dose.The apoptotic rate of experiment groups have significant difference compared with control (P<0.05).Conclusion Plant polysaccharide may induce cell apoptosis of S-180 cell line in early phase and induce necrocytosis in late phase,inbihits proliferation of mice sarcoma S-180 cell.
Key words：Plant polysaccharide;Signal transduction;Tumor;Cell apoptosis;Flow cytometry

信号转导是20世纪90年代以来生命科学研究的热点。中医中药抗肿瘤机制研究在cAMPPKA通路、磷脂酰肌醇通路、钙和钙调蛋白通路、CaCaM等方面取得新进展。茯苓多糖等多种中药多糖能抑制磷脂酰肌醇通路中的PI转化，阻断通路中下游信使分子间的信息下传，从而抑制小鼠S-180肉瘤细胞增殖。本文通过实验研究中药多糖在信号转导中诱导细胞凋亡的作用并探讨其潜在机制，为临床治疗打下实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物昆明小鼠40只,雌雄各半,6～8周龄,体重20±2g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。小鼠S-180肉瘤细胞由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。

1.1.2 实验药品茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖由湖北中医附院药理研究室提供，环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，规格0.2g/瓶。

1.1.3 细胞培养液由采用美国sigma公司生产的RPMI1640粉剂与10%的小牛血清、链霉素、青霉素G钾、5%的NaHCO3配制而成。

1.1.4 试剂碘化丙啶(ＰＩ)染色液(4℃避光保存),购自sigma公司。

1.1.5 主要仪器倒置相差显微镜、CO2培养箱DODEL2300型（美国Shellad）、流式细胞仪(美国ＢＥＣＴＯＮＤＩＳＣＫＩＮＳＯＮ公司产品)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠S-180肉瘤细胞腹水制备实验取接种7d生长良好的腹水型S-180肉瘤小鼠,颈椎脱臼处死,取腹水,用生理盐水稀释成每毫升含1×107个瘤细胞的悬液。台盼蓝染色检测细胞的存活率,活性大于90%。

1.2.2 细胞实验将传代的S-180肉瘤细胞接种于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640培养液。接种浓度为1×107个/mL,置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞生长旺盛,制备成生理盐水组、实验组,并分别加入茯苓多糖、黄芪多糖、猪苓多糖各100μg/mL（低剂量）、250μg/mL（中剂量）和500μg/mL（高剂量）。置培养箱中分别培养1h、8h,在显微镜下观察细胞生长状况。收集细胞悬液,PI染色法,流式细胞仪检测。

1.2.3 统计学处理计算机SPSS软件包,采用方差分析,统计学数据用(±s)表示。

2 结果

中药多糖体外抗肿瘤实验结果表明:中药多糖能诱导肿瘤细胞凋亡。S-180肉瘤细胞在8h细胞凋亡变化结果见图1。

图1 S-180肉瘤细胞在8小时细胞凋亡变化结果

实验表明:通过细胞实验,可知中药多糖能诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡变化结果见表1:中药多糖作用1h后,黄芪多糖组、茯苓多糖组与正常对照组有显著性差异（P＜0.05）。中药多糖作用8h后,三种中药多糖各组与正常对照组间有差异性（P＜0.05）,黄芪多糖的高低剂量组间也有显著性差异。同时,流式细胞图提示坏死细胞有增多趋势。表1 8h三种中药诱导S-180肉瘤细胞凋亡的情况变化注：*与对照组比较P＜0.05;△组间比较P＜0.05

　　3 讨论

细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束生命的生理性死亡称为细胞凋亡,也称程序细胞死亡。通过分子生物学研究发现细胞凋亡的异常与肿瘤的侵袭和转移等许多环节有密切的关系[1，2]。近年来,基因水平的研究,明确了癌基因和抑癌基因引发癌细胞的增殖与凋亡的过程[35]。中药多糖在提高人体的免疫系统方面发挥重要的作用,可能通过提高机体的免疫力来抗肿瘤,还有可能直接参与肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，这将为中医抗肿瘤治疗提供理论依据[68]。药物是如何通过信号转导通路来诱导细胞凋亡的？我们从细胞凋亡的生化特点(即细胞内信使调节)解释细胞凋亡可能的机制。细胞内信使调节集中在以下四个方面：(1)Ca2+、Mg2+浓度升高:Ca2+、Mg2+激活内源性核酸内切酶，使DNA在核小体间酶解，将DNA断裂为最小单位长度是185bp，其余的是185bp倍数的片断。Zn2+抑制内源性核酸内切酶的激活，蛋白激酶C(PKC) 的活化可引起下游Ca2+浓度升高。(2)蛋白激酶C(PKC):蛋白激酶C的生物效应是通过对众多底物蛋白磷酸化来实现的，底物如酶收缩蛋白和细胞骨架蛋白，转录因子等，影响基因的表达，可促进细胞增殖，也可抑制细胞生长，作用较广泛[9，10]。由佛波脂激活PKC，它既可促进细胞凋亡又可抑制细胞凋亡的发生，可能是PKC活性增高到一定限度时，细胞增生活性增高，越过此限度则促使细胞凋亡,其机理有待研究[11]。(3)酪氨酸磷酸酶(TPase):生长因子和生长因子受体作用后可活化酪氨酸激酶,引起细胞增殖,诱发肿瘤。使磷酸化的酪氨酸脱去磷酸,诱导细胞凋亡[12],控制细胞的过度増生。(4)cAMP/cAMP:cAMP/cGMP这两条信号通路曾被誉为中医中的阴阳,共同调节细胞内钙离子的浓度变化。通过蛋白激酶A的作用,可促使细胞凋亡[13]。实验组采取PI染色法,在流式细胞仪,通过亚二倍峰来测定细胞的凋亡情况。通过实验，我们获得的结果示: 中药多糖可以诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。中药多糖作用1h后, 茯苓多糖中剂量组，黄芪多糖高中低组能诱导肿瘤细胞凋亡,其凋亡率与正常对照组有显著性差异(P＜0.05)。茯苓多糖的高中剂量组间凋亡率有显著性差异,但茯苓多糖高剂量凋亡率与正常对照组没有显著性差异。中药多糖作用8h后,三种中药多糖也能诱导肿瘤细胞凋亡,各组凋亡率与正常对照组间有差异性（P＜0.05）,黄芪多糖的高低剂量组间凋亡率也有显著性的差异。在流式细胞仪图上，可以观察到随中药多糖作用时间的延长，肿瘤细胞凋亡率升高同时，肿瘤细胞坏死有增多趋势。从中我们可得出,中药多糖在早期可诱导细胞的凋亡,中后期引起细胞的坏死等病理改变。中药多糖可能通过信号转导通路中的一条或几条途径实现诱导细胞的凋亡，发挥自身独特的多靶点效应，在肿瘤发生发展过程中,起着一定的作用。但具体通过信号转导通路中的哪一条或几条途径起作用，这仍然需要进一步研究。我们还希望从钙离子相关通路来研究中药多糖在信号通路中的诱导细胞凋亡作用并探讨其机制。对细胞凋亡机制的进一步研究，将对认识肿瘤发生机制及预防和治疗肿瘤产生一定程度的影响。

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