关键词 博莱霉素； 细胞凋亡； 耐药机制： 肺毒性

　　博莱霉素(bleomycin，BLM)是由梅泽滨夫博土等首先从轮丝链霉(Streptomyces verticillus)分离出来的糖肽类抗肿瘤抗生素，主要对鳞状细胞癌、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤等有效；无明显骨髓抑制，不抑制免疫功能；最严重的毒副反应为肺炎样症状，可引起肺纤维化。博莱霉素由于它独特的化学结构和作用机制、对特定肿瘤的选择性效果，在抗肿瘤抗生索中占有重要地位。多年来，对BLM的研究重点集中于细胞毒作用的机制，主要集中在对靶细胞增殖周期的作用、对细胞染色体和DNA的作用等方面。近年来有关BLM诱导癌细胞凋亡、靶细胞对BLM的耐药机制以及相关基因靶点则成为新的研究热点。

1 诱导细胞凋亡
　　对细胞死亡性质的研究表明，细胞凋亡与抗肿瘤药物的作用机制有着十分密切的关系。如今已经认识到至少一些肿瘤基因和肿瘤抑制基因能够调节肿瘤生长及死亡的比率[1]。
　　在癌细胞对化学诱变剂和细胞DNA损伤制剂的反应方面，最具广泛特征的肿瘤抑制基因之一是p53，它在细胞发生凋亡的细胞信号系统中发挥作用[2-5]。利用含有AHH-1 tk+/-的人成淋巴细胞瘤细胞探讨凋亡在BLM导致突变和毒性中的作用，发现细胞死亡的开始方式是通过凋亡途径实现的，该凋亡可以被延迟，并且伴有细胞周期G2时相的阻滞。但通过对BLM处理细胞中存活的、凋亡的和坏死的细胞比例分析提示，BLM诱导DNA受损的部分细胞并未经历凋亡途径而死亡[6]。利用电渗导入方法，可使BLM在可控的条件下进入细胞内，发现BLM导致细胞死亡有两种机制，当仅有数千个BLM分子进入细胞内时．细胞周期表现为G2~M时相阻滞，细胞死亡前形态变大、多核，与离子射线引起的“核分裂死亡”一致，相反，当数百万计的BLM分子进入细胞内时，细胞形态变化与典型的凋亡一致，出现DNA断裂井非常迅速裂解成寡聚核小体大小的碎片[7]。Malcomson等利用转化有c—Ha—ras和对温度敏感性突变p53(Val135)的大鼠胚胎纤维母细胞，在32℃时细胞被阻滞于Gl期，同时有野生型p53的过量表达。这种状态的细胞表现出对BLM诱导凋亡的抗性。而在37℃时，突变的p53过量表达，细胞不被阻滞于G1期而继续增殖，井表现出剂量依赖性的凋亡，该死亡不依赖于野生型p53的功能．另一方面，含有非温度敏感性突变p53(Phc132)的对照细胞，在32℃和37℃下24h后，对BLM仍然敏感。这说明在其药物动力学或DNA损伤方面，不单单是基于温度的效应，同时p53对凋亡的调节作用也受这些特殊细胞的某些因素的影响[6]。Enokido等为了探索p53在中枢神经原有丝分裂后期的作用，从正常p53野生型小鼠和突变的无p53的小鼠得到小脑神经元，观察在各种情况下诱导性神经原死亡的情况。发现出生后15～16d小鼠的野生型p53神经原经DNA损伤剂如BLM等处理24—72h后即死亡。而来自p53-/-小鼠的神经原对BLM等表现出明显的抗性。
　　另一方面，低K+介导的凋亡不受p53状态的影响。在被γ—射线和低K+介导的细胞死亡过程中，不管是p53+/+或者p53-/-神经原，均既无细胞周期的进展，也无DNA合成。提示由DNA断链引起的有丝分裂后期的神经原的凋亡需要p53的参与[8]。
　　是什么触发了p53的表达和凋亡的发生呢，Nelson等利用含有野生型p53等位基因的人细胞系的实验，发现DNA损伤剂如BLM等能够迅速导致DNA断链，并立即触发p53蛋白水平的升高，另则通过喜树碱刺激的拓扑异构酶I—DNA复合物不能充分提高p53蛋白的水平的升高。另则通过喜树碱刺激的拓扑异构酶I-DNA复合物不能充分提高p53蛋白的水平，而与复制相关的DNA断链却是所必须的；进一步通过电穿孔法使核酸酶进入细胞，也能刺激p53蛋白水平的迅速升高，说明DNA链断裂就可充分启动p53—依赖信号的传导，但DNA损伤而非断裂时则不能触发p53的诱导[9]。Muller等通过BLM对肝癌细胞的细胞毒机理的研究，发现治疗中患者的血清中有核野生型p53的瞬间增加，以及携有野生型p53的肝癌细胞HcpG的细胞表面受体CD95(APO-1／Fas)的高调节表达。但BLM不能增加携有突变p53(Huh7)或p53-/-(Hip3B)肝癌细胞的CD95。在携有野生型p53的HcpG2细胞中，CD95介导的凋亡的敏感性增高，将野生型p53cDNA微量注射入HepG2细胞也得到了同样的结果。相反，BLM不能增加Huh7和Hep3B细胞经CD95介导的凋亡的敏感性；进一步发现在BLM治疗的HepG2细胞中，CD95配体(CD95L)mRNA的表达增高，值得注意的是BLM对HepG2细胞诱导的凋亡，几乎完全被干扰CD95受体／配体相互作用的抗体所抑制。提示BLM诱导的凋亡至少部分为p53依赖的CD95受体／配体系统的激动所介导。这为解释癌症治疗中的敏感性和耐药有重要意义[10]。CD95受体／配体系统是凋亡的一个特殊介导者，氧化作用的重点已经与细胞凋亡的诱导相关连。Hug等利用药物诱导凋亡模型以探讨是否CD95配体mRNA通过反应氧的媒介而诱导。用BLM对HepG2肝癌细胞的治疗，诱导反应氧介导产物，作为氧化作用的一个参数，即谷胱甘肽(GSH)的耗竭，同时诱导了CD95配体mRNA的表达；以相似的方式，在H2O2治疗后CD95配体mRNA表达也增高了。而用抗氧化剂和GSH前体N-乙酰半胱氨酸，可使细胞内GSH水平部分回复以及对CD95配体mRNA诱导作用的降低，当用N-乙酰半胱氨酸和去铁胺联合治疗时，BLM对CD95配体mRNA的诱导进一步降低。提示在CD95配体的诱导中氧自由基的直接作用[11]。
　　除p53外，还发现BLM诱导凋亡与其他基因有关。有证据表明在DNA损伤所诱导的凋亡中，p53介导着对bcl-2基因的负调节及对bcl-2基因家族成员bax的正调节[12－14]。尽管从分子水平上，对Bcl-2家族的功能尚不完全了解，然而已知其可形成带有死亡抑制因子或者死亡效应子活性的同二分子聚合物或者杂二分子聚合物。其中死亡抑制因子活动与Bcl-2[15]和bcl-X—bcl-X，长拼接变异体表达水平增高相关[16－18]。相反，发现19kDa的Bax[15]，属于bcl-X和bel-X1，短拼接变异体表达产物[19－20]，和Bak能促进细胞死亡[21－22]。可是也发现Bak对无血清EB病毒转化的成淋巴细胞瘤细胞系的死亡有抑制作用[22]。个体蛋白配偶体的相对比例调节凋亡的途径，例如Bcl-2／Bcl-2同二聚物或者Bcl-2／Bax异二聚物的比例增高，与阻抑凋亡有关，反之Bax／Bax同二聚物比例增高，则促进细胞死亡[15，23，25]。当bcl-2的表达升高时，对受DNA损伤药物作用的细胞的凋亡途径起抑制作用[26]。
　　另外，有研究BLM对髓细胞样的白血病U937细胞的效果，该细胞转染有鼠bcl-2或者单纯的仅含有新霉素抗性基因MNC的载体。次致死性浓度(1g／L)的BLM抑制了含有单纯载体和bcl-2转染的两种U937细胞的生长。被MNC转染的细胞在BLM处理4d后，失去了克隆形成及存活的能力，伴有G0-G1时相细胞的堆积、形态学上的改变及其髓细胞样分化相关标志的表达(如颗粒性的增加和CD11b表达)，但在第6天分化的细胞便通过凋亡途径消失了。相反，在BLM处理的2周内，bcl-2转染的细胞保留有存活的和克隆形成的细胞，这些细胞没有G0～G1时相的堆积，表现出分化标志的延迟表达。这提示Bcl—2不仅对阻滞细胞凋亡有正调节作用，而且也能延迟或者防止分化细胞发生凋亡[27]。新鲜分离的大鼠肝细胞的凋亡，可被培养时缺乏胎牛血清、加入蛋白激酶C的抑制剂——多粘菌素B和staurosporine所诱导：肝细胞对BLM敏感，30min DNA就可出现高度断裂，多粘菌素B和staurosporine在作用3h后诱导出DNA的降解，该效果部分可被佛波醇肉豆蔻酸乙酸盐(phorbol myristate acetate，PMA)所防止，但在作用8h后，PMA则不能对抗这一作用及肝细胞的凋亡。提示肝细胞存活中蛋白激酶C的意义[28]。

2 耐药机制
　　一些研究表明靶细胞对BLM耐药除与细胞膜的通透性有关外，认为调节细胞凋亡的基因在决定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性方面发挥着重要的作用。克隆了bcl-2家族的一个基因bcl-X，利用能稳定过量表达bcl-XL的细胞系，试验是否bcl-XL的表达能影响肿瘤对化疗药物的敏感性，发现bcl-XL表达能戏剧性地减小BLM等的细胞霉作用，但不能防止细胞周期的阻滞，确切地讲仅能防止细胞凋亡。Bcl-XL表达的细胞在药物作用去除后仍能保持细胞的增殖能力。有趣的是bcl-XL表达的细胞，经长春新碱处理再去除药物后，变成了多倍体细胞。这些资料表明bcl-XL能使细胞抵抗来自广泛不同的、作用于细胞周期多部位的凋亡的刺激，具有多重耐药表型，可见bcl—XL的表达可能是化学治疗效应的一个重要指示物[28]。
　　人骨肉瘤细胞系Saos-2缺少内源性p53基因，遂将野生型p53或突变p53(Ala123、Ala143、His175和His273)转染至Saos-2细胞，再以BLM等化疗药治疗后观察其存活分数。发现与转染有p0PI3(仅表达质粒)的细胞相比，转染有Ala123、His175和His273突变p53的细胞表现出更大的抗性。但具体对每个药的敏感和抗性又有区别，如转染有野生型p53和Ala123突变p53的细胞对尼莫司汀(ACNU)更敏感，转染有Alam突变p53的细胞对多柔比星(即阿霉素，ADR)更敏感，而BLM对Saos—2和上述各种转染类型的细胞之间的敏感性没有明显区别。说明细胞对抗癌药的敏感性随p53基因突变点不同而异[30]。
　　实验证明对BLM的耐药性也与目的DNA的修复功能有关。nfi基因产物核酸内切酶V(脱氧次黄嘌呤核苷3’核酸内切酶)在DNA修复方面有重要作用。该基因的插入突变，一些标志比自然突变增加2倍，同时也增力BLM和呋喃妥因杀伤的敏感性。有证据表明核酸内切酶V在DNA的脱氧腺苷(次黄苷)脱氨基和不能步移位点的修复方面起重要作用，但尚无关于断裂体内单链或者含尿嘧啶DNA的证据[31]。药物引起的细胞毒或者凋亡可以受抑瘤基因p53的表达及特殊肿瘤基因的表达的影响，意味着在细胞毒反应中有界限阈。有人将野生型p53 cDNA次克隆到pGRE5-2／EBV载体，可被地塞米松诱导过度表达，再转染到肺泡横纹肌肉瘤Rh30细胞，该细胞能表达Pax3／FKHR融合蛋白和突变的p53表型。发现对p53依赖的敏感性以BLM、放线菌素D、5—氟尿嘧啶等较高(≥4倍)，多柔比星、topotecan、依托泊苷、顺铂等较低(≤2倍)[32]·。
　　细胞内BLM水解酶活性与其耐药机理和毒性密切相关[33]，现已认识到编码BLM水解酶(半胱氨酸蛋白酶)的人基因与化疗抗性有关，该基因由12个外显子和11个内含子组成，大于30kb，外显子和内含子的数量和分布与既往报道的人类其他半胱氨酸蛋白酶不同．人BLM水解酶基因的5’-侧区域的1.2kb的核苷酸序列分析，发现高含GC，CpG／GpC比率接近整体，象TATA盒或CCAAT盒均缺失。所有这些特征与管家基因的特征一致，正说明了该酶在人体组织广泛表达的原因。该基因5’-侧区域也含有多形态的CCG三核苷酸重复，这也可能是基因不稳定事件的一个靶位，可影响该基因的转录活性。该基因定位于染色体17q11．2，与多发性神经纤维瘤1型基因的位置很近[34]。
　　总之，BLM耐药是临床上的主要问题，分子肿瘤学的任务之一就是阐明其潜在的机理，并以此去寻找和发展更有效的治疗。已指出BLM等化学药物耐药与下列几个方面有关：(1)膜转运系统的P-糖蛋白家族的放大或者过度表达，降低了细胞内药物的浓度；(2)细胞内有解毒作用的蛋白质的变化，如谷胱甘肽S-转移酶pi、金属硫蛋白、人MutT同系物、BLM水解酶、二氢叶酸还原酶等，或者对化疗药物有活化作用的蛋白质，如DT-硫辛酰胺脱氢酶、细胞色素P-450还原酶等；(3)DNA修复有关分子的变化，如6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、DNA拓扑异构Ⅱ、hMLH1、p21WAF1／CIP1等。(4)癌基因的活化，如Her-2／neu、bcl-2、bcl-XL·、c-myc、ras、c-jun、c-fos、MDM2、p210BCR-abl、突变p53等。人们正着眼于与耐药有关的癌基因上，以期改变它们的功能而达到消除耐药的目的[35]。

3 肺损伤的机理
　　BLM是一个有效的抗肿瘤药物，可它的累积毒性常常引起炎症，并可发展成肺纤维化。众所周知，肺泡上皮2型细胞(T2细胞)在BLM损伤的修复过程中发挥着重要作用，假设T2细胞对BLM损伤的抗性与其抗氧化系统活性的增高相关。通过腹膜给予BLM(1.5mg／d)14d后，经支气管肺泡灌洗，覆盖细胞的数量明显减少，中性粒细胞显著增多而巨噬细胞却明显减少，这时显微镜下并无纤维化的迹象。然而T2细胞经14d治疗后出现肿胀，并出现增大的薄层包涵体，细胞乳酸脱氢酶(LHD)明显降低，而BLM反而引起超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPA)活性明显增高，细胞内谷胱甘肽降低，而Y-谷氨酰转肽酶活性显著升高。说明BLM诱导了T2细胞抗氧化剂系统的改变，特别是谷胱甘肽系统的变化[36]。有人检测了BLM诱导的小鼠肺纤维化中凋亡的发生与Fas抗原(Fas)／Fas配体(FasL)的关系。雄性ICR小鼠气管内滴入BLM(5u／kg)，对照滴入消毒盐水，在BLM作用不同时间分别处死小鼠，以反转录多聚酶链反应(RT-PCR)测定Fas mRNA和FasL mRNA的表达，Fas mRNA的定位分析用原位杂交，FasL mRNA定位分析用原位RT-PCR。结果表明：支气管细胞和肺泡上皮细胞迅速发生凋亡，并在1d之内消退，在第7天重新出现凋亡并持续14d以上，同时伴有纤维化进展，而皮质类固醇完全能阻断凋亡和纤维化。肺泡上皮细胞Fas mRNA的表达上调，浸润的淋巴细胞中FasL mRNA的表达也上调，皮质类固醇在抑制凋亡和纤维化时，同时抑制Fas mRNA和FasL mRNA的表达。尽管这些结果不能说明凋亡由Fas／FasL系统所介导，而凋亡与BLM引起的纤维化直接相关，仍可推测过度凋亡和Fas／FasL系统在BLM导致的肺损伤中起着一定的作用[37]。其机理据推测也与肺泡巨噬细胞(AM)有关。有人以体外试验研究了BLM对AM的毒性及热休克蛋白(HSP或应激蛋白)在这一过程中的作用。尽管BLM不能引起明显的坏死，通过原位DNA标记测定到DNA碎段．在BLM作用24h后DNA梯子的形成也证明了这一点。该DNA碎段的形成可被10和50mmol／L ZnCl所阻断，提示BLM诱导了凋亡．BLM不能改变细胞内原癌基因bcl-2或谷胱甘肽的水平，然而在中度热应激下(39.8℃)4h，BLM能使HSP-72表达降低50%，该抑制却没有影响HSP-72的mRNA水平和所有蛋白质的合成。说明BLM阻滞了相对特异的应激反应和转录后过程。提示BLM诱导凋亡先于对热休克蛋白诱导的抑制[38]。
　　综上所述，BLM类药物是具有独特结构和独特作用的一类广谱抗肿瘤抗生素．对肿瘤细胞各周期都有毒性作用，但主要使细胞阻滞于G2期。主要作用位点为DNA，能造成DNA各级结构的异常，表现出很强的诱变及使单链、双链断裂的作用，由此可导致染色质损伤和染色体畸变。这些主要与BLM一金属离子络合物在氧化还原过程中释放自由基的直接攻击密切相关。而BLM的细胞毒作用与诱导细胞凋亡、肿瘤基因和抑癌基因的存在及其与活性、耐药机制等关系的研究已经取得了一些很有意义的发现，今后更是研究的重点。