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活血渗湿方对实验性肝纤维化的作用研究

2010-08-03 22:07:16 作者：新特药房来源：中国新特药网天津分站浏览次数：61 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】［目的］确定活血渗湿方抗实验性肝纤维化的疗效。［方法］用经典四氯化碳肝纤维化模型进行活血渗湿方药效试验,并与复方鳖甲软肝片、干扰素等进行对照观察。［结果］血清HA检测、病理组织学观 ...

【摘要】
［目的］确定活血渗湿方抗实验性肝纤维化的疗效。［方法］用经典四氯化碳肝纤维化模型进行活血渗湿方药效试验,并与复方鳖甲软肝片、干扰素等进行对照观察。［结果］血清HA检测、病理组织学观察显示活血渗湿方治疗组、IFNγ治疗组及复方鳖甲软肝片治疗组之间均无显著性差异(P>0.05),但与生理盐水阴性对照组比较差异显著(P<0.05)。［结论］活血渗湿方具有显著的抗实验性肝纤维化的作用。

【关键词】肝纤维化;活血渗湿方;复方鳖甲软肝片;干扰素;实验研究

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（No:399004）和浙江省中医药科研基金（No：2000C10）
　　Experimental Study of Anti Hepatic Fibrosis of Bloodactivating and Dampnesseliminating Decoction (BDD)

　　Zhang Yongsheng，Lu Liangwei，Cai Weimin，et al

　　Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou ( 310053)

　　Abstract: ［Objective］ To define the therapeutic effect of BDD’s antiliver fibrosis.［Methods］ Take classical carbon tetrachloride liver fibrosis model to make pharmacodynamic test of BDD and compare it with Fufang Biejia Ruangan tablets (FBRT) and Interferon γ( INFγ).［Results］ By observing serum HA test，pathology and histology，it indicates that there is no marked difference among BDD treatment group，IFNγ treatment group and FBRT treatment group (P>0.05)，but there is obvious difference compared with normal saline negative control group ( P<0.05).［Conclusion］ BDD has the function of antiexperimental liver fibrosis.

　　Key words： liver fibrosis，BDD，FBRT，INFγ，experimental study

　　肝纤维化是各种慢性肝病（包括病毒性、酒精性、血吸虫性等）的共同病理学基础，是发展至肝硬化的必经阶段。有研究表明慢性肝病发展到肝纤维化或早期肝硬化时是可逆的，但如果发展到晚期肝硬化就不可逆转了。所以肝纤维化尚未发展到肝硬化前，及早阻断和逆转肝纤维化，是防治慢性肝病致肝硬化的关键［1］。活血渗湿方是导师卢良威教授在长期的临床研究中总结出来的经验方，在临床应用及前期的实验研究中已经初步显示出了显著的抗肝纤维化作用［2］。本研究旨在研究活血渗湿方抗肝纤维化的疗效。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 SD大鼠200只，雌雄各半，清洁级，体重180～220g，购自中科院上海实验动物中心，由浙江中医药大学实验动物中心提供饲养条件，自由饮水，预养10天后进入实验阶段。

　　1.2 药物活血渗湿方浸膏制剂：方药由穿山甲、山慈菇、黄芪、茯苓及水红花子等组成，由浙江中医药大学中医门诊部提供，用自动煎药机制备，浓缩成为生药含量为6g·ml-1的浸膏备用。干扰素γ：由上海克隆生物高技术有限公司制造，100万IU/支，批号：970521。复方鳖甲软肝片：由内蒙古集宁制药厂制造，0.5g/片，批号：20000903。

　　1.3 模型制作及分组设正常组大鼠20只。其余SD大鼠用于肝纤维化模型的制作。将四氯化碳与橄榄油按4∶6比例配成40%油剂。按0.3ml/100g体重课题皮下注射，2次/周。每周末随机处死2只大鼠观察肝脏组织学变化，直到中度肝纤维化形成。分组：造模8周后，中度肝纤维化形成，随机选取10只模型大鼠作为干预前对照。将模型大鼠随机分为以下几组，给药剂量按照“等效剂量”的换算方法计算活血渗湿方、复方鳖甲软肝片及干扰素的等效干预剂量如下。

　　(1)活血渗方干预组：以活血渗湿方复方煎液按10g·kg-1生药量灌胃，1次/天；(2)复方鳖甲软肝片阳性对照组：软肝片用蒸馏水溶解，按0.625g·kg-1体重灌胃，1次/天；(3)IFNγ阳性对照干预组：IFNγ20万U·kg-1体重，肌注，1次/天；(4)生理盐水阴性对照组：以生理盐水2ml/100g灌胃，1次/天；(5)另设正常对照组20只，灌服同样剂量的生理盐水。

　　每周称量大鼠体重以调整药物的剂量，连续用药12周后，取血，处死大鼠，取大鼠肝脏置中性福尔马林液中固定，行常规HE染色、特殊染色及免疫组织化学标记染色。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 血清学全部大鼠摘取眼球取血，分离血清进行肝功能检测，包括血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALb）、白／球蛋白比例（A/G）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等生化指标；并检测大鼠血清透明质酸（HA）。

　　1.4.2 组织学观察取大鼠肝脏左、右叶各1块，立即用10%中性磷酸缓冲液（PBS，pH=7.0，以下同）福尔马林液中固定，固定过夜后取材，按1×1×0.2cm大小，标记后流水冲洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡，常规石蜡包埋切片，进行常规染色及特殊染色和免疫组织化学检测。

　　评定标准：HE染色，观察肝组织炎症和汇管区纤维化情况，与苦味酸—天狼红染色对照，判定炎症和纤维化程度并记分；苦味酸—天狼红染色：显示肝组织胶原增生情况，与常规病理学的HE染色对照，并且在偏光显微镜下区分Ⅰ、Ⅲ型胶原，判定肝组织纤维化程度并分级；氨银－Masson网织纤维染色，采用“氨银－渡边改良法”进行氨银媒染并显示肝窦基底膜增生和网织纤维分布情况，与HE染色和苦味酸——天狼红染色共同对照观察，判定纤维化程度［3］。

　　按实验动物肝纤维化组织学Ⅵ级标准进行肝纤维化程度评判［45］。０级—正常肝组织；Ⅰ级—少量胶原纤维自汇管区或中央静脉向外延伸；Ⅱ级—纤维延伸明显，但未包绕整个肝小叶；Ⅲ级—纤维互相连接包绕整个肝小叶；Ⅳ级—纤维分隔肝小叶形成假小叶，但以大方形假小叶为主；Ⅴ级—假小叶中大方形假小叶和大圆形假小叶各占50%；Ⅵ级—肝内布满小圆形假小叶，其间充满粗大增生的纤维组织。其中Ⅳ级为早期肝硬化（肝纤维化），Ⅴ～Ⅵ级为肝硬化期。

　　1.5 统计学处理采用SPSS11.0统计软件进行数据的统计分析，血清TP、ALb、A/G、ALT、AST、HA及羟脯氨酸含量均以均数±标准差表示。先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件的行单因素方差分析，组间比较应用Student—Newman—Keuls检验，纤维化积分采用秩和检验，P<0.05，差异有显著性意义。

　　2 结果

　　2.1 一般情况总计200只SD大鼠，肝纤维化模型复制成功108只，进入干预阶段。随机选取10只，作为干预前对照。在实验过程中有56只大鼠死亡，除去每周处死用于前期每周肝纤维化程度观察的大鼠16只，复制过程中大鼠的死亡率达28%，与国内外的文献报道相仿。在大鼠模型复制过程中，大鼠的皮毛逐渐变得直立，色泽无光，体重的增长不明显，消瘦，进食量下降，大便稀溏，容易受到外界刺激的影响。与正常的大鼠有明显的不同。

　　2.2 肝功能检测（见表1）肝功能TP、A/G、及AST检测各组之间均无统计学意义（均P>0.05）；正常组与模型组大鼠肝功能Alb、ALT检测有统计学意义，差异显著（P<0.05）；活血渗湿方、复方鳖甲软肝片及IFNγ组间肝功能各项检测比较差异不显著，无统计学意义（P>0.05）。
　　
　　表1 肝功能检测结果（略）

　　用SPSS11.0统计软件进行方差分析，与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

　　2.3 血清HA检测情况正常组大鼠HA水平与模型组、各治疗组、生理盐水阴性对照组之间两两比较均有显著性差异（P<0.05）；模型组血清HA水平与各治疗组之间比较均有显著性差异（P<0.05）；各治疗组分别与生理盐水阴性对照组比较，均有统计学意义，差异显著（P<0.05）；但活血渗湿方治疗组、复方鳖甲软肝片治疗组、IFNγ治疗组之间比较均无统计学意义（P>0.05）。

　　表2 血清透明质酸（HA）检测结果（略）

　　与模型组比较，*P<0.05

　　2.4 组织学观察

　　2.4.1 常规HE染色及特殊染色结果。常规HE染色及苦味酸——天狼红染色病理学检查可见，正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞多为单核，肝板呈条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，天狼红染色显示小叶间和汇管区基本无胶原纤维分布，仅在中央静脉及肝窦内有轻微的胶原纤维分布，在偏光显微镜下基本不见红黄及绿色的胶原纤维；在氨银Masson网织纤维染色下可见肝组织窦周间隙内有轻微的网织纤维着色，网织纤维成分总体较少。模型组大鼠HE染色中可见大量肝细胞脂肪变性存在，呈空泡状，另有水样变性甚至气球样变，近90%标本可见散在的不同程度的坏死肝细胞，在汇管区和小叶间有大量炎症细胞浸润，正常肝小叶结构遭到破坏；天狼红染色下可见汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，组织切片中有大量假小叶形成，并且以小圆形为主，偏光显微镜下区分可见红、黄色成分居多，主要为Ⅰ型胶原；在氨银Masson网织纤维染色切片上可见肝组织被分隔成为大小不等的假小叶，遍布大方形或小圆形假小叶，肝组织内满布绿色的网织纤维，在汇管区及纤维间隔内尤其明显，在窦周间隙内有明显的网织纤维着色，网织纤维成分显著增多（见图1、2）。

　　图1 模型组大鼠HE染色图（略）

　　图2 模型组天狼染色图（略）

　　表3 各组肝纤维化分级情况（略）

　　在活血渗湿方治疗组标本中，可见肝细胞炎症不显著，但肝组织内可见不同程度的炎症细胞浸润，变性坏死以脂肪变为主，可见少量脂肪变性空泡。在天狼红染色下可见肝组织胶原纤维增生不明显，一般仅局限于汇管区。复方鳖甲软肝片和IFNγ治疗组镜下观察基本与活血渗湿方治疗组相近，但是生理盐水阴性对照组的组织学观察显示,肝组织炎症程度明显，汇管区有大量纤维组织增生，其中多数纤维间隔已经相连，将肝小叶分隔成为大量的假小叶，在偏光显微镜下可见有粗大增生的胶原纤维（见照片3、4）。

　　图3 软肝片组镜下观察图（略）

　　图4 活血渗湿方镜下观察图（略）

　　对照以上病理学观察结果及表3数据，进行x2检验，结果（1）各治疗组与生理盐水阴性对照组比较，P<0.05，说明活血渗湿方、复方鳖甲软肝片以及IFNγ均有抗肝纤维化作用；（2）活血渗湿方治疗组与复方鳖甲软肝片及IFNγ治疗组比较，P>0.05，提示活血渗湿方的抗肝纤维化作用与复方鳖甲软肝片及IFNγ疗效相似。

　　2.4.2 免疫组织化学标记染色。免疫组织化学染色显示，虽然正常肝脏组织中有轻微的PDGFB、TGFβ1、TIMP1、αSMA、CⅣ、LN等细胞因子的表达，但是模型组与活血渗湿方治疗组及其余各治疗组、阴性对照组的阳性率显著高于正常对照组，尤其以模型组最为显著。

　　3 讨论

　　活血渗湿方是导师卢良威教授在长期的临床实践中，经过筛选而成的经验方。全方由黄芪、巴戟天、丹参、赤芍、水红花子、泽兰、茯苓及穿山甲等药物所组成。其中黄芪配伍巴戟天补益肾中精气。肾阳、肾阴为人体阳气、阴精的根本，且肝肾同源，故补肾可以调控肝的功能，此亦养正除积之大法；丹参、赤芍、穿山甲活血化瘀。尤其穿山甲，性善走窜，内达脏腑经络，能活血化瘀，消癥积，通经脉。水红花子、泽兰、茯苓、黄芪活血利湿。全方组合，切中肝纤维化的病机所在，达到活血渗湿，消除肝脏纤维结缔组织的作用，共奏“活血渗湿”之功。

　　从本研究所得的数据中显示，活血渗湿方能够显著降低由四氯化碳所致肝纤维化大鼠的肝组织中细胞外基质的含量，从而减低肝纤维化的分级。但该方从何种机制中达到相应的抗肝纤维化作用，尚待今后进一步深入研究。

　　从表2的肝纤维化大鼠模型实验中各组对血清肝功能的影响结果显示，各组之间对肝功能的影响并没有显著性差异（P>0.05），但表3中的肝纤维化指标HA及表4中的组织学观察肝纤维化程度差异显著（P<0.05）。提示肝功能反映的仅仅是肝脏损伤的程度及代偿功能，与肝纤维化程度相关性不大，考察血清HA水平则可在一定程度上反映肝纤维化改变的程度。HA水平明显地反映了肝脏胶原水平，各组之间差异显著，各治疗组与生理盐水阴性对照组、模型组以及正常组之间均有统计学意义（P<0.05），其中的阴性对照组与各治疗组之间的差异基本上验证了大多数抗肝纤维化研究的结果，治疗各组（活血渗湿方、IFNγ、复方鳖甲软肝片）之间差异无统计学意义（P<0.05），显示活血渗湿方有降低血清肝纤维化指标的作用，与IFNγ、复方鳖甲软肝片基本无明显的差异。

　　本研究采用常规HE染色结合苦味酸-天狼红染色观察汇管区及增生的肝脏假小叶的胶原成分改变，并且利用氨银Masson网织纤维染色来显示肝窦部位的胶原与基底膜沉积改变状况，结合苦味酸-天狼红染色能够在偏光显微镜下同时显示Ⅰ、Ⅲ型胶原，比较直观地在同一个视野中显示两者的变化，值得今后进一步采用。从模型组与治疗组的肝组织天狼红染色切片中发现，胶原纤维增生中基本上围绕肝小叶周围形成，后期以假小叶形成、肝小叶基本结构破坏为主要特征，汇管区有炎性细胞浸润。从常规病理学及免疫组织化学染色中发现，活血渗湿方与复方鳖甲软肝片及IFNγ治疗组对肝组织胶原纤维增生的影响无显著性差异（P>0.05），显示三者之间作用相近。但三者与阴性对照组比较均有统计学意义（P<0.05），从另一个侧面反映了其有效性，值得在今后进一步探讨“活血渗湿方”的作用机理。

　　从实验中对实验性肝纤维化大鼠血清学、常规病理学及免疫组织化学染色的观察中发现，活血渗湿方对肝纤维化大鼠肝功能等指标的影响不大，但与各对照组之间比较差异无显著性意义（P>0.05），分析原因可能与四氯化碳等造模损伤因素仅为启动因子有关。肝脏在受到损伤因子作用下，逐步启动纤维组织增生的修复反应。在此过程中，肝功能逐步得到恢复，但是肝纤维化的进程仍在持续进行。这与国内外有关肝功能与纤维化的相关性之间不显著的诸多报道基本相符。

　　综上研究结果分析，活血渗湿方对肝纤维化指标—HA的影响以及对组织学改变程度上，与“复方鳖甲软肝片”及IFNγ的作用相似。提示活血渗湿方在抗肝纤维化作用上有相当的研究开发潜力，值得今后进一步研究。作为现代中药来说，浸膏制剂尚不能完全与现行的注射剂及片剂等同日而语，应该就制剂等方面作一定的优化，以利于新药开发的需求。