摘 要：本研究探讨Propentofylline对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。采用鲁米诺依赖的全血化学发光法测定fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。结果显示Propentofylline以浓度依赖形式抑制中性粒细胞产生过氧化氢，并增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用，但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。结果提示，Propentofylline通过抑制细胞对腺苷的摄取，增加局部腺苷水平，增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用。这种作用也可能是Propentofylline保护心脑组织损伤的机制之一。
The Effects of Propentofylline on Human Neutrophils
ZHANG Yu　BA Tu(Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)

Abstract：In this study, we tested the effects and mechanisms of propentofylline on human neutrophils. The neutrophils were stimulated by fMLP (formyl-MetLeuPhe) and hydrogen peroxide was determined by the luminol amplified chemiluminescence. Results showned that propentofylline inhibited the hydrogen peroxide production by neutrophils in concentration-dependent manner. The inhibitory effect of adenosine on fMLP-stimulated neutrophil hydrogen peroxide was markedly increased in the presence of propentofylline. But that of NECA (5`-N-ethylcarboxamidoadenosine) was unaffected, indicated that the inhibitory effect of propentofylline on neutrophils was mediated by inhibiting adenosine uptake and increasing the local concentration of adenosine. This effect could be a mechanism of the protective effects of propentofylline on the ischemia of brain and heart.
　　Key words：adenosine;propentofylline;hydrogen peroxide
　　Propentofylline，是新的黄嘌呤衍生物，已经显示对心脑组织缺血具有保护作用，机制可能与其扩张血管，增加能量恢复及降低脑组织水肿有关[1]。由于中性粒细胞在组织缺血再灌注损伤中起着重要的作用，因此，我们研究了Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。用甲酰基-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒细胞，采用鲁米诺反应测量中性粒细胞产生的过氧化氢含量。
　　材料和方法
　　1.试剂
　　腺苷或其衍生物N-已基-羧酰氨基腺苷(NECA)的浓度为0.01, 0.1, 1, 10 μmol．L-1。 Propentofylline的浓度为10, 30, 100, 300, 1000μmol．L-1。Hank 平衡盐溶液。细胞激化剂(fMLP)1μmol．L-1。
　　2. 测定方法
　　2.1 中性粒细胞的分离
　　取健康成年人血30～50 ml,肝素抗凝, 用Percoll细胞分离液分离细胞，参照Wright法[2]进行，离心后收集中性粒细胞，用PBS冲洗二次，蒸溜水溶解污染的红细胞。冲洗后的细胞再用Hank 平衡盐溶液配成理想的浓度1×106/ml，计数所得细胞，以中性粒细胞比例＞90%（革兰染色）及细胞活力＞95%（台盼蓝拒染）为合格。
　　2.2 过氧化氢的测定
　　采用鲁米诺依赖的全血化学发光法(CL) 参照Wymann法[3]进行，这是测定中性粒细胞呼吸爆发非常敏感的方法。不同浓度的药物加到含中性粒细胞的试管中，在37°C条件下水浴5 min后，fMLP激活细胞，细胞释放的CL用Luminometer测定。CL峰值代表中性粒细胞产生过氧化氢的量。数据表达采用与对照组的百分比。所有药物在无细胞情况下均不影响鲁米诺系统。
　　2.3 统计学处理
　　所有数据均为平均值和标准差，来源于4～8个试验。显著性差异用t检验方法测定。
　　结果
　　1. Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用
　　Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢，表现为浓度依赖性抑制，随着浓度的增加，抑制作用增强（见图和表1）。
Table1.The effect of propentofylline on hydrogen
    proxide in fMLP-stimulated neutropjils(mean±SD，n=4)Fig1.The effect     of propentofylline on hydrogen proxidein fMLP-stimulated neutrophils.
　　2. Propentofylline 对腺苷作用的影响

　　腺苷和NECA均抑制中性粒细胞产生过氧化氢。并随着浓度的增加其抑制作用增强。低浓度的Propentofylline （1μmol．L-1)不影响腺苷对中性粒细胞的作用（数据未显示），而高浓度的Propentofylline （100μmol．L-1）明显增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用P＜0.05,最大抑制率由66%升到81%。然而，NECA对中性粒细胞的抑制作用不受Propentofylline 的影响p＞0.05（见表2）。

Table2.The effects of adenosine and NEDA on hydrogen proxide production in the presence
or absence of propentofylline(mean±SD,n=8)

讨论　　组织缺血激活中性粒细胞产生大量氧自由基，与细胞膜上的脂质结合，引起细胞膜功能失调，导致细胞内钙超载，细胞死亡[4]。缺血也刺激腺苷的产生，现已证实，腺苷抑制中性粒细胞粘附到内皮细胞，降低氧自由基释放。血管内皮细胞通过释放腺苷阻止激活白细胞对内皮细胞的损伤[5]。然而，由于外源性腺苷对心血管系统严重的副作用，如低血压和窦性心动过缓，临床应用受到限制。近年来研究趋于促进内源性腺苷的产生或抑制细胞对腺苷的摄取，利用内源性腺苷发挥作用。
　　与以往的报道相同，腺苷抑制fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。Propentofylline增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用，但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。这与脑组织研究结果类似，在那里，Propentofylline 增加腺苷所引起的cAMP水平，却不影响NECA所引起的cAMP水平，表明Propentofylline发挥作用在腺苷受体激活以前。因为NECA与腺苷代谢途径不同, 机制可能象文献报道的那样，Propentofylline抑制细胞对腺苷的摄取，增加局部腺苷的浓度所致[6]。
　　腺苷通过其受体发挥作用，腺苷A2受体通过细胞膜上的Gs蛋白兴奋腺苷环化酶使细胞内的ATP变成cAMP, cAMP在磷酸二酯酶的作用下形成5誂MP。cAMP是细胞内重要的第二信使，cAMP通过蛋白激酶A，使细胞发生反应。Propentofylline也是磷酸二酯酶抑制剂[7]，可以推测Propentofylline可能通过增加cAMP浓度增加腺苷对中性粒细胞的抑制作用。
　　结论：Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢，可能的机制通过抑制细胞对腺苷的摄取，增加局部腺苷的水平，发挥腺苷的作用。这也可能是它保护心脑组织缺血性损伤的机制之一。