背景和目的: 肝脏纤维化对丙肝患者而言是一项重要的影响预后的因素。 聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)单独使用或联合利巴韦林治疗肝脏纤维化的效果还未被证实。方法: 我们从4个随机临床试验中收集了3010个初发患者治疗前及治疗后的肝穿刺活检标本。十种不同的联合标准干扰素、聚乙二醇干扰素以及利巴韦林的方案作了比较。每种方案的疗效评估是依据METAVIR评分中肝脏的坏死和炎症程度好转至少一级的患者的百分比，恶化至少一级的患者的百分比以及每年的纤维化进展的速度。结果: 坏死和炎症程度改善的百分比为39%(用干扰素24周)--73%(最佳剂量的PEG-IFN 1.5mcg/kg联合利巴韦林；P<0.001)。 纤维化恶化的百分比为23%(用干扰素24周)--8%(最佳剂量的PEG-IFN 1.5mcg/kg联合利巴韦林；P<0.001)。与治疗前相比，所有的治疗方案都显著地减缓了纤维化进程。在153名原有肝硬化的患者中有75名发生了逆转(49%)。治疗后纤维化的好转与6个独立因子相关: 原有的肝硬化程度([OR]=0.12；P<0.0001)、持续病毒应答(OR=0.36；P<0.0001)、年龄<40岁(OR=0.51；P<0.001)、体重指数<27kg/m2(OR=0.65；P<0.001)、炎症非活动或轻微活动(OR=0.70；P=0.02)，以及病毒载量<3.5×106copies/ml(OR=0.79；P=0.03)。结论: 聚乙二醇干扰素联合利巴韦林能显著地减缓丙肝患者的纤维化进程。
全世界范围内约有1亿7千万人感染了慢性丙型肝炎病毒(HCV)。肝脏组织学的纤维化程度是疾病严重度的重要指标，因为丙肝的自然病程可以使肝脏纤维化逐渐进展并最终导致肝硬化。大多数与慢性感染相关的并发症都发生在形成肝硬化的患者3-5。治疗可以终止或减缓肝纤维化进程，理论上是有益的6。
过去我们曾经报道过联合干扰素和利巴韦林的方案可以减缓肝纤维化进程，甚至在一些患者中可以发生逆转。对纤维化的治疗效果与治疗反应和干扰素的疗程有关7。
近来研究显示，与标准干扰素相比，聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)在产生持续病毒应答方面效果显著提高。单一治疗8-10或联合利巴韦林11治疗的效果都有显著提高。但是这些新的方案在组织学改善方面的效果还没有明确的验证8-11。
本项研究的目的是比较各种不同的方案(PEG-IFN单独使用或联合利巴韦林)在减缓纤维化进程和炎症坏死程度方面的效果以及识别这些变化的危险因素。这项分析主要是明确在已清除病毒患者和未清除病毒患者中的治疗效果。
材料和方法
从4个随机临床试验获取关于长效干扰素α-2b（PEG-IFN，先灵葆雅公司产品）8单独治疗，或联合利巴韦林11，或干扰素α-2b联合利巴韦林(先灵葆雅公司产品)12-13治疗的数据。血清学确诊的慢丙肝病人如果有治疗前后肝穿标本对照的也包括在内。重叠HBV或HIV感染的，每天酒精消耗量大于50克的以及有其他肝脏疾病的患者(血色病，自身免疫性肝病，α1抗胰蛋白酶缺乏症，脂肪肝)被排除在外。在所有的临床试验中，对研究可能造成的结果进行阐明后签署了知情同意书。所有关键的试验都有预期的相似设计，主要是相同的组织学和病毒学的方法8，11－13。
建立一个综合了4个临床试验的数据库，包括以下内容: 性别、第一次肝穿刺的年龄、感染的年龄、体重指数、推测的感染模式(肠道外的，通常是静脉用的药物、输血以及其他未知因素)、治疗的类型(PEG-IFN+利巴韦林，IFN+利巴韦林，PFG-IFN，IFN)、疗程(24周或48周)、METAVIR肝纤维化分级、在第一次和第二次肝穿刺时的炎症活动度、两次肝穿刺相隔的时间、在治疗前、治疗结束时和随访结束时(治疗结束后六个月)的病毒载量，以及HCV的基因型。十种不同的治疗方案作比较: 标准干扰素(α-2b，3MU， 每周3次[TIW]) 24周，标准干扰素48周，PEG-IFN 0.5 (0.5 mcg/kg) 48周， PEG-IFN 1.0 48周， PEG-IFN 1.5 48周， 标准干扰素-利巴韦林(体重<75kg，1000mg；>=75kg，1200mg) 24周， 标准干扰素-利巴韦林 48周， 1.5 PEG-IFN 1月后换用0.5 PEG-IFN -利巴韦林(体重<75kg，1000mg；>=75kg，1200mg)(本方案为指定的0.5 PEG-IFN -利巴韦林)，小剂量利巴韦林(10.6 mg/kg或更少)联合1.5 PEG-IFN， 以及大剂量利巴韦林(大于10.6 mg/kg)联合1.5 PEG-IFN。大剂量利巴韦林(大于10.6 mg/kg)联合1.5 PEG-IFN是目前欧洲地区的推荐方案， 因为剂量<=10.6 mg的利巴韦林效果较差11。在这些方案中，3个不是依据体重调整的: IFN单用24 周或48周以及小剂量利巴韦林联合1.5 PEG-IFN。由于缺乏未治疗的随机队列，第一种方案（IFNα-2b，3MU， TIW， 24周）被视为对照组，其他9组相应的作为加强组。
使用标准技术进行肝活检，依据METAVIR评分方法评估纤维化等级和炎症活动程度14－15。纤维化等级评分为0－4：F0=没有纤维化；F1=门静脉区有纤维化但没有纤维间隔形成； F2=少量纤维间隔形成；F3=大量的纤维间隔但没有肝硬化；F4=肝硬化。病理学家用这种方法重复实验结果得到了确认14。从正常肝脏或门脉区纤维化（F0/F1）进展到门脉区以外的纤维间隔形成（F2/F3/F4）(在本文中称为“显著纤维化”)呈现了由HCV感染所导致的疾病进展情况，最终形成肝硬化（F4）。以上提到的炎症活动度（炎症坏死的密度，多数为坏死）分级如下：A0=组织学上炎症不活动；A1=轻微活动；A2=中度活动；A3=严重活动。在这些研究正进行中，而没有相关的临床、生化、治疗方案的相关资料时，一名病理学家(Zachary Goodman)分析了这些肝活检结果。
在所有4个临床研究中，由洛山叽一个中心实验室测定了血清HCV-RNA水平。运用了反转录酶的循环聚合酶链反应，可测得的低限为50 IU/ml(100 copies/ml)16。测定的中位数为3.5×106copies/ml，相当于1.3×106 IU/ml17。HCV基因型也作了测定18。
肝脏纤维化进程的评估: 3种方法进行分析
第一种，我们比较各种不同的治疗方案，依据纤维化程度好转至少一级、维持稳定和恶化至少一级的患者百分比。
第二种，我们比较不同的治疗方案，依据治疗前后纤维化进展的速度。这些评估以前已被广泛的叙述和确认。
治疗后的纤维化进展速度是依据两次肝穿(治疗前后)之间METAVIR评分变化比例的不同和两次肝穿相隔的时间来评判的。治疗前的纤维化进程是依据治疗前肝穿刺的纤维化METAVIR评分和估计感染的持续时间来评判的。由于这些评估的非正态分布以及非线性曲线，只有中位数和非参数检验被运用。过去的研究中，我们已经通过比较成对的肝穿结果确认了评估的结果(对照组的队列随访和多因素分析)2。
第三种，我们比较各种不同的治疗方案，依据其他的危险因子进行多元分析。关键点是第二次肝穿为显著纤维化的患者百分比。
关于炎症活动度(坏死和炎症)的评估，依据炎症程度好转至少一级、维持稳定和恶化至少一级的患者百分比。我们选定METEVIR评分中坏死和炎症好转一级的为较大的改变。METAVIR评分中的一级相当于Knodell指数中的四级14-15。这是组织学改善的通常定义的两倍。
最后，我们验证了关于加强治疗组(9种治疗方案，包括IFN或PEG-IFN单一治疗48周或联合利巴韦林治疗)与对照组(标准干扰素α-2b，3MU， TIW， 24周，只有5% 获得持续病毒应答)比较，可以逆转肝硬化(依据肝穿刺标本上纤维化评分的改变)的假说。如果与对照组相比出现更多的逆转，那么将强烈提示与未治疗组相比会有更显著的效果。为此，我们比较了对照组和加强治疗组之间的基线肝硬化逆转的患者百分比。当然，考虑到有取样误差存在，我们比较了各组间肝穿标本的大小。
统计方法
四个随机临床试验都包括3至4个组(表1)。不同的临床试验中有相同的治疗方案。因此，有些是在随机组之间比较(“直接比较”，如在Poynard试验中IFN-R 48周与IFN 48周比较)，有些是合并组的比较(Poynard、 Hutchison、Manns试验中的IFN-R 48周与Poynard、 Hutchison、Lindsay-Trepo试验中的IFN 48周比较)。因此，我们做了两次分析，一次是在直接随机组之间比较，一次是在合并组间比较。表2显示了每个临床试验的每一组的详细资料。单一变量在不同变异度的计数资料等级检验用t检验、Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验(在多个比较中用Bonferroni方法)。计量资料用 Fisher exact检验，中位数差异用Wilcoxon符号等级检验20。多元分析用逻辑回归分析的方法20。治疗后肝穿刺显示没有明显肝纤维化的患者百分比的独立相关因素用逻辑回归模式评估。该模式评估下列因素:利巴韦林联合治疗(是或不是)，疗程(24或48周)，干扰素(聚乙二醇化或不是)，第一次肝穿刺的年龄(小于40岁)，性别，基因型(第一次分析时为2或3或其他，然后3或其他，因为基因型3型与肝脏脂肪变和纤维化相关)，基线病毒载量(低于或高于中位数1.3×106 IU/ml)，纤维化分级(F0/F1或F2/F3/F4)，第一次肝穿刺时炎症的活动度(A0/A1或A2/A3)，持续病毒应答(或不是)，复发(是或不是)，体重指数(低于或高于中位数27)，以及对比的两次肝穿刺的标本大小以减少取样误差(大于或小于中位数30mm)。持续应答定义为在治疗结束时和结束后24周血清HCV-RNA为阴性(<50 IU/ml)，无反应定义为治疗结束时和结束后24周HCV-RNA为阳性。
结果
四个临床试验中4493名初发患者中有3010名患者完成了前后两次肝穿刺，并在这过程中完成了平均为20个月的治疗(表1)。在本次分析中有两次肝穿标本的人群与原始样本人群之间没有统计学的差异。基线资料显示，2243名患者没有显著的肝纤维化(75%)，767名患者有显著肝纤维化(25%)，673名患者没有显著的炎症活动(22%)，2337名患者有显著的炎症活动。美国1880名患者的平均体重为84 kg，与非美国地区的平均体重为74 kg相比(P<0.0001)。
讨论
纵观4个随机临床试验，我们可以对10种不同的治疗方案在改善丙肝患者肝脏组织学方面作出评价。至少在2年的组织学随访中，这些治疗24周或48周的方案使我们看到了肝脏坏死和炎症分级的改善和纤维化进程的缩短。分析也显示组织学的改善与病毒应答和一些基线因素相关。PEG-IFN联合利巴韦林的治疗使50%以上的患者根除了病毒，因而具有潜在的预防肝硬化的作用，这一方案比过去的标准干扰素联合利巴韦林的治疗效果好7。在随访结束时，一半有基线肝硬化的患者用加强方案治疗后肝硬化消失。
与以上的分析相比较，在用上述三个主要危险因子（病毒应答，纤维化分级，年龄）调整之后，一个新的因素----体重指数表现出与肝硬化之间的显著相关性。性别可能是一个混杂因素，在考虑了体重指数之后它的相关性消失了。在所有这些临床试验的治疗和随访过程中，患者的饮酒量都没有考虑在内。这是本次研究的缺陷。大量饮酒是一个排除标准，但是饮酒量的改变可能对肝硬化的进程产生一定的影响。然而这些治疗方案都是随机的，可以排除一些主要的偏倚。
这项综合了个体数据的分析研究有三个方法学上的弱点：1.并不是所有入选患者都有两次肝穿刺结果；2.在单个的前瞻性临床试验中缺乏10种不同治疗方案直接的随机比较；3.缺少未治疗的对照组。由于所有的随机入选患者和有两次肝穿刺患者的人群间并无差异（表1），因此，与患者选择相关的偏倚可以排除。在单个前瞻性临床试验中，随机直接比较10种不同治疗方案，尚缺乏实践的可行性。而每个新的临床试验的设计都包括了先前的标准治疗方案在内。PEG-IFN单一治疗的临床试验开始于1997年，在标准干扰素联合利巴韦林临床试验结束（1998年）之前。虽然缺乏10种不同治疗方案之间的随机比较，但是这些方案都同时与标准治疗方案做随机比较。并且，联合所有四个临床试验的数据是可行的，因为这些试验在设计时都是围绕一个终点，且所有已知的预后因素都作了一元和多元的分析。比较干扰素单一治疗和未治疗对照组的第一个临床试验的资料无法获得。然而，对慢丙肝患者自然病程的改善效果方面，第一个推荐的治疗方案（IFN 3MU TIW 24周）在以前的随机临床试验组织学比较的多因素分析中已经得到证实2，6，21－23。70个未治疗患者两次肝穿刺结果显示17 ％的患者出现了炎症活动度方面的改善，64 ％的患者出现了纤维化程度的恶化2，6。就目前的研究而言，干扰素单一治疗24周使37 ％的患者炎症活动度得到改善，24 ％的患者纤维化分级恶化。即使在保守方法中，第一种推荐治疗方案仍被视为治疗对照组，但治疗之后仍可出现转机。最后一种推荐方案（PEG-IFN联合大剂量利巴韦林）在组织学改善方面效果最突出：73 ％的患者出现了炎症活动度的改善，只有8 ％的患者纤维化分级恶化。
各种不同的治疗方案在病毒应答方面效果依次递增：PEG 1.5-大剂量利巴韦林治疗方案产生持续病毒应答率（63 ％）比第一种推荐方案（5 ％）高58 ％。当产生持续病毒应答反应时，组织学的改善都是相同的，与治疗方案无关：86 ％的患者出现炎症活动度的改善，只有7％的患者出现纤维化分级的恶化。
用加强方案治疗之后患者肝硬化逆转的百分比高得惊人（52 ％）。在肝硬化可以治愈的结论得出之前必须强调本研究的局限性24。肝硬化逆转的定义是基于肝穿刺标本纤维化分级评分的改变。取样误差（特别是标本较小时）还是可能发生的，尤其在3级（广泛纤维化）和4级（肝硬化）之间。然而在肝硬化逆转的患者和肝活检没有变化的患者之间没有肝穿刺标本大小的区别。如果我们分析3级和4级肝穿标本，仍然可以发现50 ％的患者纤维化有显著的改善（数据未显示）。在炎症活动度改善和肝硬化逆转之间的相关性得到证实：随访第二次肝活检显示没有或仅有轻微坏死炎症的患者与仍然有肝硬化的患者相比约为2倍。在肝硬化逆转和病毒应答以及炎症活动度改善之间的高度相关性不能用取样误差来解释。出现肝硬化逆转的患者都比较年轻，而且早期的肝硬化更容易逆转。这个大规模的前瞻性研究最终确立了一个关于广泛纤维化的新的分型，称为“可逆的肝硬化阶段”。由于这些临床试验的随访时间在治疗后都小于48周，出现持续病毒应答的患者纤维化改善是否能长期维持需要通过较长的组织学和病毒学的随访研究评价。近期出现的非侵袭性的纤维化生化指标的检查可能有帮助25。
非应答患者与应答患者相比，纤维化改善不明显，纤维化进程更快。然而认为联合治疗方案或单用干扰素方案对无应答患者没有价值是错误的。比较用干扰素治疗无应答患者与非随机配对的未治疗患者的纤维化进程，我们和其他一些研究学者观察到干扰素可以延缓纤维化进程（虽然与持续应答患者相比效果要差得多）。这些是在一个关于肝脏坏死和炎症程度的随机临床试验中得到证实的23。在目前这个研究中，我们发现与治疗前相比纤维化进程得到延缓，尤其是那些本来有显著纤维化的患者。因为关于纤维化进程是否是线性的还不肯定，我们只能使用中位数或非参数统计的方法。不考虑17年间疾病进展方面的信息是不公平的。每个患者第一次肝穿刺的纤维化分级体现了细胞外基质形成和降解的平衡。治疗后的纤维化进程估计的缺点是两次肝穿刺之间相隔的时间太短，平均为20个月。没有获得持续应答的患者是否停药过早还有争议26。这些治疗方案如果在治疗未起效之前就停药，那么他们在抗纤维化和组织学改善方面是否有效必须谨慎考虑，尤其是那些显著纤维化的患者。对于纤维化快速进展的患者，即使病毒仍然是可测得的，还应当使用该治疗以阻止纤维化进程和肝硬化并发症27。对这些随机临床试验的回顾性分析显示维持治疗有两种选择: PEG 1.0单一治疗(最简单也是耐受性很好的方案)或PEG-IFN 0.5-利巴韦林(对非应答患者在改善炎症坏死方面最有效的方案)。这些方案尚待今后进一步证实。
这项研究使我们确认了体重指数是与显著纤维化相关的主要因素，甚至对那些经过治疗的患者而言。至少有两个原因可以解释这个相关性。第一，干扰素和利巴韦林的治疗效果都与合适的剂量有关，而这些剂量都需要依据体重调整11。第二，纤维化的进展和机体代谢有高度相关性。近来研究发现，超重的患者肝脏纤维化的危险性增加，尤其是那些体重指数大于27的患者28。自这项研究开始以来，患者的平均体重(尤其是美国的患者)逐渐增加。在第一项联合临床试验中(1995年)体重指数大于27的美国患者百分比为43%，而在第二项试验(1997年)时达51%，在最后一项试验(1998年)时达57%。在非美国患者中，三个相应比例分别为28%，28%和32%。
我们得出结论，PEG-IFN联合利巴韦林的治疗通过减缓肝纤维化进程和减少肝硬化的发生而潜在地减少慢丙肝的发生率和死亡率。这种效果在获得持续病毒应答的患者中更明显，尤其是使用PEG-IFN联合大剂量利巴韦林的方案可以获得最佳效果。没有基线广泛纤维化，小于40岁和体重指数小于27的患者无论是否获得持续病毒应答，肝硬化的进程慢得多。慢丙肝患者的肝硬化逆转是可能的。