|
【摘要】目的： 探讨针对转化生长因子β1（TGFβ1）的小干扰RNA（siRNA）对大鼠肾间质细胞系（NEK293）TGFβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用. 方法： 利用RNA干扰（RNAi）效应设计针对TGFβ1的不同siRNA，构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系. RTPCR和Western Blot分别检测TGFβ1 mRNA及蛋白的表达，细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化. 另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照. 结果： siRNA转染效率70%，特异性siRNA对TGFβ1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用（P>0.05），实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加（P>0.05）. 结论： 应用RNAi技术可明显抑制TGFβ1的表达，并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡. 【关键词】 转化生长因子β1；肾纤维化；RNA干扰
肾纤维化是肾脏多种损伤,如创伤、缺血、肾移植术后慢性排异反应及尿路梗阻等修复的共同转归. 长期以来，肾纤维化被描述为不可逆的静止性瘢痕组织，但近年来的研究认为纤维化实际上是一个动态过程，其特征为细胞外基质（ECM）迅速重建和长期的成纤维细胞激活［1］，已知的主要效应细胞为成纤维细胞、肾间质细胞等. 体外研究［2］表明，转化生长因子β1（TGFβ1）是肾间质细胞的主要调控因子. 本研究应用TGFβ1特异性小干扰RNA(siRNA), 以质粒载体转染大鼠肾间质细胞NEK293，观察特异性siRNA对TGFβ1的表达，NEK293细胞周期及凋亡的影响. 1材料和方法 1.1材料HEK293细胞（美国Clontech公司）；Lipofectamine（美国Gibco公司）；RTPCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；化学发光试剂，（美国Santa Cruz公司）；噻唑蓝显色剂（MTT）、碘化丙啶（PI）荧光染料、TritonX100打孔剂（美国Sigma公司）；DOSPER脂质体（美国Roche公司）；荧光显微镜（德国Opton公司）；TECAN sunrise型自动酶联免疫检测仪，coulter Epics XL流式细胞仪，LS6500液闪计数仪（美国Beckman公司）. 1.2方法 1.2.1特异性siRNA设计及载体的构建候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,去掉与人类RNAs同源性的靶序列，最后选取3个siRNA. 根据pSilencer3.1H1质粒载体使用说明，将编码siRNA的双链互补DNA片段插入该载体的BamHI/HindⅢ位点之间以制备发夹cDNAs［3］. 表达这3种siRNA的重组质粒分别命名为psiRNA1,2,3. 以BamHI和HindⅢ酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小，并对纯化的siRNA片段进行DNA测序分析. 另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照. 1.2.2细胞培养及转染HEK293细胞以含100 mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培养，2 d换液1次. 取对数生长期细胞进行实验. 按lipofectamineTM2000脂质体转染法，将5 μg psiRNA(13)和无意义对照质粒转染到HEK293细胞中，6 h后更换正常培养基，12 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率. 1.2.3RTPCR检测psiRNA1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞（细胞总数为1×107个）按Trizol试剂操作步骤提取总RNA，选用一步法RTPCR试剂盒. 具体参数及条件根据引物的Tm值和扩增片断的大小进行调整. 1.2.4Western Blot检测收集各组细胞并以PBS洗涤及细胞裂解液裂解，提取总蛋白，电泳及转膜后进行常规免疫反应，显影、定影后将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值. 1.2.5MTT比色实验1×104 HEK293细胞接种于96孔培养板, 37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培养1 d. 按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200 nmol/L的siRNA，中止培养4 h前加入MTT，应用酶标仪进行检测. 检测490 nm波长处的吸光度A值,计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率(%) = (1-A实验组/A对照组) ×100%. 1.2.6细胞凋亡检测3 mL培养液含5×105细胞培养于6孔板，用预冷的700 mg/L乙醇固定，4℃过夜，PI（50 mg/L）染色，分析亚二倍体峰. 调整细胞密度为5 ×106/mL，取1 mL细胞悬液，1000 r/min 4℃离心10 min，重复2次，将细胞重悬于200 μL结合缓冲液，加入10 μL膜连蛋白Ⅴ (Annexin V2F ITC)和5 μL碘化丙锭(PI) ，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况. 1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照用以监测转染效率. 按说明书转染, 24 h后收集细胞, PBS洗涤后固定在20 g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测. 统计学处理： 以SPSS11.0软件进行分析. 组间差异比较采用方差分析及LSDt检验，P<0.05为差异具有统计学意义. 2结果 2.1siRNA转染效率流式细胞分析显示，几乎所有的细胞都摄取了GFP的绿色荧光. 由于siRNA分子远小于质粒分子，故转染siRNA时转染效率应大于70%（图1）. A: siRNA1组; B: siRNA2组; C: siRNA3组. 图1各实验组siRNA表达载体转染×200（略） 2.2TGFβ1 mRNA及蛋白的表达特异性siRNA处理后24 h TGFβ1 mRNA表达水平明显降低，与非特异性siRNA组mRNA的表达水平相比较有显著差异（表1，图2）. 特异性siRNA转染24 h TGFβ1蛋白表达水平明显下调，与非特异性siRNA转染组比较差异有统计学意义，TGFβ1 mRNA及蛋白表达在实验组间无显著差异（表1，图3）. 表1脂质体介导的siRNA表达载体转染24 h后对TGFβ1表达的影响（略） aP<0.05 vs 阴性siRNA对照和阳性siRNA对照. A： 非特异性siRNA对照； B： 特异性TGFbeta siRNA1； C： 特异性TGFbeta siRNA2； D： 特异性TGFbeta siRNA3； M： DNA marker. 图2RTPCR检测TGFβ1 siRNA转染后TGFβ1 mRNA表达（略） A： 阴性siRNA对照； B： 阳性GAPDH siRNA对照； C： 特异性TGFbeta siRNA1； D： 特异性TGFbeta siRNA2； E： 特异性TGFbeta siRNA3. 2.3特异性siRNA抑制细胞增殖特异性siRNA转染HEK293细胞24 h后,细胞增殖平均抑制率与非特异性siRNA转染细胞组相比细胞增殖抑制明显增强（P<0.05，表2）. 表2特异性siRNA转染HEK293细胞24 h后对细胞凋亡和增殖的影响（略） aP<0.05 vs 阴性siRNA对照+lipo. 3讨论 TGFβ1的纯化始于上世纪70年代末，是多功能生长因子的原型［4］. 纤维化的肾组织有较强TGFβ1表达，并与纤维化的程度相关［5］，来自大鼠及人的成纤维细胞在经过TGFβ1处理后都显示出Ⅰ型胶原和纤维蛋白合成增加. Fire等［6］发现RNA分子操纵着许多细胞功能，可通过互补序列与DNA结合，从而关闭或降解已表达的基因. 通过逆转录病毒表达载体，在人肿瘤细胞特异性抑癌基因KRAS V12，可以导致非依赖生长和成瘤性的丧失［7］. HIV1 ref mRNA依赖siRNA的有效降解在HIV1前体蛋白和产生siRNA的结构共转染的细胞中获得［8］. 本研究根据siRNA序列设计原则，候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,选取3个针对TGFβ1的siRNA表达载体经转染入HEK293细胞后，均起到RNA干扰的作用，对TGFβ1 mRNA和蛋白以及下游信号蛋白的活化水平都能明显抑制，明显下调细胞增殖并诱导细胞凋亡. 针对每个基因需要设计并检测多个siRNA序列，由于每一siRNA序列在与mRNA结合过程中，发挥降解作用的效率不同. 因此，根据RNAi设计原理一般设计3个位于不同位置RNAi序列，进行载体构建，细胞转染，功能鉴定等. 3个RNAi序列均有RNA沉默的效果，只是效率不同，在转染入细胞后根据RTPCR或Northern杂交检测mRNA表达，用Western杂交检测相应蛋白表达，才能确定RNAi的效果［9］. 由于mRNA的二级结构及作用机制尚不完全清楚，如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计［10］. 本研究采用的RNAi序列在实验中显示出较高的抑制率，为肾纤维化的治疗提供了实验基础. 【参考文献】 |
RNAi抑制NEK293细胞TGFβ1表达的研究简介：
【摘要】目的： 探讨针对转化生长因子β1（TGFβ1）的小干扰RNA（siRNA）对大鼠肾间质细胞系（NEK293）TGFβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用. 方法： 利用RNA干扰（RNAi）效应设计针 ... 责任编辑：admin
|
最新文章更多推荐文章更多热点文章更多 |
中国新特药网-第一时间提供全球医药资讯
注： 本站药品信息仅供医药研发机构作参考-
在线咨询：
- 鲁ICP备05035203号 @