80年代以来，伴随现代分子生物学，免疫生物学和肿瘤免疫学的飞速发展，基因治疗血液系统恶性肿瘤倍受关注，基因治疗的概念也从过去对缺陷基因原位修复或异位替代拓展到把通过基因操作来调控某些与疾病有关的基因表达并使之正常化，或导入细胞因子及其它功能基因，以发挥杀死肿瘤细胞、抗细胞增殖、促肿瘤细胞凋亡或增强机体抗肿瘤免疫等。现就恶性血液病目前研究现状作一综述。

　　㈠自杀基因的转入 病毒、细菌、真菌与哺乳动物不同，前者通常采取单一的代谢途径，而哺乳动物细胞中含有编码多种酶的基因，执行体内各种代谢和能量转换，某种特异的酶常常是药物作用的靶位。药物可杀伤或抑制带有该种酶基因的细胞，激活药物产生的毒性仅局限于具有激活药物酶基因的细胞及／或其微环经经境中。这种激活药物的酶基因被称为自杀基因。据这一原理，人们给肿瘤细胞转入自杀基因，使之对无毒或低毒的药物前体产生高度敏感性，从而选择性杀伤肿瘤，但对宿主细胞无害，因为宿主细胞缺乏激活药物的该酶基因。常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)等。Moolten[1]首次报告转入HSV-TK基因的肿瘤细胞，对丙氧鸟苷(GCV)高度敏感，而且用转染后的肿瘤细胞给小鼠注射后，用GCV治疗有效。Santodonato[2]等给小鼠接种表达α-INF的Friend 红白血病细胞，可以抑制FLC肿瘤的转移。如果用同时表达HSV-TK和α-INF的Friend 红白血病细胞系接种小鼠后，用GCV治疗，未见肿瘤发生，疗效70～100%。最近Bonini[3]将HSV-TK基因用于临床，证明转染HSV-TK的异基因骨髓细胞骨髓移植临床。他们对８例复发或EB病毒诱导的ML，在接受去T细胞骨髓移植后在输注HSV-TK 转染的供体淋巴细胞，5例产生有效抗肿瘤效应，3例发生严重GvHD，用GCV治疗，去杀灭HSV-TK转导的淋巴细胞。这说明通过对供者淋巴细胞的基因操作，可增加异基因骨髓移植的有效性和安全性，扩大了其应用范围。

　　胞嘧啶脱氨酶(CD)基因也是一种自杀基因，其产物CD能将无毒的5-FC转化为5-FU。5-FU继续被转化为单磷酸5-FU和三磷酸5-FU，阻断胸苷合成酶合成和mRNA 转录。Mullen(4)等用CD转染来源于C57BL/6小鼠的弱免疫株和纤维瘤细胞，发现肿瘤生长受受抑，将上述瘤细胞皮下注射同基因小鼠，随后全身用5-FC治疗，也取得了良好效果。

　　鉴于HSV-TK和CD的治疗效果令人鼓舞，其它一些自杀基因也相继被发现，如细胞色素P450、dck等，为肿瘤自杀基因的治疗提供了更新的方法。

　　㈡免疫基因治疗 主要包括细胞因子基因治疗和细胞因子联合基因治疗。前者主要是将各种细胞因子基因，如IL-1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、G-CSF、α-INF、γ-INF、α-TNF等，转染细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞( TIL)等抗癌效应细胞、肿瘤细胞、造血干细胞等，借助细胞因子去激活CTL， 以补偿辅助T淋巴细胞不足，加强对低免疫原性肿瘤细胞的识别等。 后者是把两种或两种以上有协同作用细胞因子基因或细胞因子与B7基因、主要组织相容性抗原(MHC)基因、抗原基因、自杀基因等联合转染肿瘤细胞，达到改变肿瘤细胞表面免疫特性，更有效杀伤的目的。

　　Jiang(5)等将IL-2基因成功地导入髓系白血病细胞K562中，使之对LAK 细胞介导的细胞毒作用敏感性提高。葛林阜[6]等观察了人IL-6基因转移的、能高分泌IL-6的FBL-3红白血病细胞对机体抗肿瘤免疫功能的影响。结果发现高分泌IL-6 的红白血病细胞接种小鼠体内后，能显著提高小鼠脾脏CTL、NK活性及IL-2诱导的LAK细胞活性，小鼠脾细胞诱生的IL-2、TNF和GM-CSF水平亦增高。

　　在研究提高抗癌效应细胞杀伤力的同时，人们也在探索如何增加瘤细胞的免疫原性，有效地激活机体抗肿瘤免疫。MHC抗原在肿瘤免疫中起十分重要作用， 肿瘤抗原必须与MHC相连才能被识别和排斥，即双重识别，反之，则易于逃避免疫监视作用。Weber［７］将MHCⅠ类抗原转染到缺乏MHCⅠ类抗原表达的肿瘤细胞上，发现抗原提呈作用增强，易于被CTL识别。B7分子是抗原提呈细胞的协同刺激分子。在整个抗肿瘤免疫中，激活T细胞的反应必须依赖肿瘤细胞上B7分子表达，而且含B7 的肿瘤细胞又可通过刺激机体对邻近无B7的肿瘤细胞产生排斥反应，应用B7转导肿瘤细胞注射可治愈60%野生型EL-4淋巴瘤小鼠。但在有些情况下需将B7和MHC基因共同导入肿瘤细胞才能发挥作用。在联合基因治疗中，许多实验已证明其抗肿瘤效果较单用细胞因子有显著提高。但也有少数报道应用某些瘤苗后非但不能诱导针对肿瘤的有效免疫反应，甚至会产生负性结果，因此治疗时应注意细胞因子作用的双重性，细胞因子分泌水平及荷瘤机体免疫状态。

　　㈢调节癌基因和抑癌基因正常表达 肿瘤的恶性增生从生物学角度看主要表现在两个方面，一是其"不灭性"，即凋亡障碍，二是细胞分裂的失控。以细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDKs)为中心的细胞周期素(Cyclins)-细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDKs)-细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制蛋白(CDIs) 细胞网络调控系统对细胞的正常生长和分化起了重要作用。CDK活性的异常与肿瘤发生之间可能有着密切的关系。有证据表明，某些肿瘤CDK基因本身即发生了缺陷、扩增等异常改变，如 CDK4 和CDK6在某些肿瘤和细胞系中有明显的扩增和异常表达。CDK的底物之一Rb、P21重要的上游调节因子P53等更被证明为重要的抑癌基因，它们对细胞周期的循环、增殖和分化都有广泛的影响，同样也影响着细胞凋亡。

　　P53是已被确认的抑癌基因之一，定位于17号染色体短臂， 大多数血液系统恶性肿瘤的细胞系均有P53基因改变。Oren(8)研究P53 基因和细胞因子对髓细胞白血病细胞系死亡的影响，发现有或无细胞因子的情况下，均能影响细胞程序性死亡的信号转导。P53基因的野生型(WtP53)和突变型均参与死亡的调节，但作用效果不同.WtP53具有促进凋亡的作用，而突变型则对凋亡有抑制作用。将 WtP53 基因转染无P53基因的白血病细胞中，细胞出现死亡，当P53突变时则丧失启动死亡的能力，用抗P53蛋白的单抗则有效地介导培养中的白血病细胞出现死亡。

　　bcl-2基因在造血细胞中表达于较为原始的细胞表面， 是具有抗调亡效应的一中癌基因。bcl-x是bcl-2的同源蛋白和相关蛋白，bcl-x、bax、bcl-2 三者形成了一个调亡调控系统。bcl-2抑制调亡必须通过与bax形成异源二聚体来实现[9] 。Guedez[10]等对bcl-2的不同表达水平抗Arc-c进行了定量分析，滤泡性淋巴瘤RL-7细胞系表达高水平bcl-2，而髓白血病细胞U-937表达低水平bcl-2，与大剂量Arc-c共培养后比较，RL-7细胞系显示较多集落形成，如果上调U-937细胞系bcl-2水平，可增加抗Arc-c抗药性，减少细胞调亡至少3数量级。Keith[11]等对7例高表达bcl-2的AML患者细胞体外转染反义bcl-2，可明显减少bcl-2mRNA，诱导调亡，并可增加Ara-c致调亡作用。而转染促调亡基因bcl-x致白血病细胞，可明显增强化疗药物诱导调亡作用，而不引起正常骨髓细胞调亡。

　　在众多的抑癌基因中MTS与更多的肿瘤形成和发生有关， 且能调节细胞周期并抑制细胞生长。MTS基因所表达的蛋白P16是迄今为止所发现的人类第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分。已发现在大多数而恶性血液病及恶性肿瘤中有P16 基因的缺失和突变，突变率发生最高者是T-ALL及T-淋巴细胞系。

　　nm23是目前被国内外学者瞩目的抑制肿瘤转移基因，已被用于临床对肿瘤转移的检测中。许多动物实验已证明，它虽然对肿瘤的形成及大小无作用，但对瘤体的转移有明显抑制，这为我们利用该基因开展基因治疗提供了新的思路。

　　除了对抑癌基因的研究外，近年反义核酸技术的发展，在特异地抑癌基因过度表达及抗肿瘤治疗中也取得了重大进展。 反义核酸涉及反义 DNA 、 反义 RNA 和Ribozyme，三者通过特抑地作用于转录或翻译的不同阶段而发挥特异的抑制作用。Smetsers[12]等转染反义bcr-abl，可使ph(+)白血病细胞株BV173调亡，减少CML克隆形成，使K562对化疗复敏感。Synder[13]等证实核酶能抑制ph(+)细胞系bcr-abl基因表达，抑制细胞生长率84%，但毕竟这一工作刚起步不久，需更多的实验依据来进一步证实。

　　㈣耐药基因治疗 将耐药基因转入造血细胞，既可使骨髓免于由通常化疗药物引起的骨髓抑制[13]，又可加大化疗剂量，尽可能多的杀伤肿瘤细胞。目前主要用于实体瘤的基因治疗，在恶性血液病中主要是淋巴瘤的治疗。多相耐药基因(MDR1)、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR) 等基因耐药基因的细胞转导均已证明对不同抗肿瘤药物的抗药性

　　多相耐药(MDR)始终是影响恶性血液病化疗成功的障碍。目前已知MDR有三种类型[14]:典型MDR，非典型MDR和非p-gpMDR。非p-gpMDR不编码p-gp，其基因表达与MDR无关，因此称多药相关蛋白(MRP)基因。非典型MDR与DNA拓扑异构酶的质和量有关，该酶活性或结构异常的临床意义尚未明确。研究较多的是典型MDR，主要是耐药的临床逆转和保护正常骨髓细胞造血功能。有人发现用生长因子刺激一些肿瘤细胞系或增加bcl-2原癌基因的表达，可显著提高肿瘤细胞的抗药性，并最终导MDR，这一发现提示，细胞变为化疗药物耐受的途径之一是通过启动封闭调亡的基因bcl-2而实现的，控制bcl-2等基因表达，则可提高抗癌药物的敏感性，防止MDR发生。O`shaughnessy[15]等对转移性乳腺癌患者经4-5个疗程化疗后，选择PR且骨髓未受侵者，取外周血干细胞和骨髓，用抗CD34抗体和免疫吸附获得CD34细胞亚群，并通过逆转录病毒转入MDR1基因，转入MDR1基因的CD34细胞与未转导基因及为外周血干细胞一起重新注入病人体内后，则可耐受高剂量的ICE化疗。MGMT基因编码DNA修复蛋白，在DNA损伤修复中起重要作用。转染编码MGMT cDNA的细胞，可增加对亚硝基脲类药物的抗药性，因此可在增加化疗药物的同时减少骨髓受抑程度。降低外源性MGMT表达，常可观察到由应用亚硝基脲化疗所致的骨髓抑制。Maze[16] 等用转染MGMT和模拟转导的骨髓细胞移植给小鼠，并且每周注射可引起小鼠全血细胞减少的卡氮芥剂量，5周后，转染MGMT小鼠92%存活，而移植模拟转导骨髓细胞的小鼠 53%存活，两者有显著差异，证明MGMT可有效增加白细胞、血小板数量和红细胞压积。6-氧-苄甲基鸟嘌呤是哺乳动物烷基转移酶灭活剂，埃希氏大肠杆菌的MGMT，即ada，对6-氧-苄甲基鸟嘌呤灭活作用的抵抗作用较哺乳动物强。Harris[17] 将骨髓转染ada小鼠进行6-氧-苄甲基鸟嘌呤和卡氮芥治疗，观察基因克隆数和动物存活期，发现转染ada小鼠对6-氧-苄甲基鸟嘌呤和卡氮芥的抗药性比NeroR转染的细胞强2倍，存活期也在一定治疗剂量范围内明显延长。

　　此外，还有一些耐药基因，如转染二氢叶酸还原酶(DHFR)基因细胞能保护细胞免受MTX、TMTX毒性作用。胸苷酸合成酶、核糖核酸还原酶、 拓扑异构酶和微管蛋白等，由于基因突变致酶或蛋白的功能减弱或消失，与相应的抗肿瘤药物结合减少，从而避免了这些药物对细胞的损害。

　　综上所述，尽管目前恶性血液病基因治疗的实验研究取得了可喜的进展，临床应用也受到人们广泛关注，但是由于恶性血液病类型较多，发病机制非常复杂，基因治疗结果也不甚满意，尚有许多关键问题亟待解决。主要是:①目的基因太少;②因导入技术尚缺乏定向性;③基因导入后无法进行精确调控;④体内外、实验研究与临床结果往往不一致。相信随着肿瘤病因学、发病学分子基因及分子生物学技术等基础学科不断发展和完善，基因治疗作为恶性血液病整体治疗的一部分，一定会有突破性进展。

　　作者单位：（兰州军区总医院血液病研究所 兰州 730050）

　　 参考文献

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