【摘要】
目的 观察肿瘤间质内应用替莫唑胺缓释剂 (P-TMZ) 对人脑胶质瘤的抑瘤效应。 方法 先以MTT法测定P-TMZ对SHG-44胶质瘤细胞的抑瘤效应，加药96 h后检测不同药物浓度在570 nm处的OD值，计算其IC50;再将SHG-44细胞接种于NC系裸小鼠右腋皮下，待肿瘤生长至体积约100 mm3时，将荷瘤鼠随机分为P-TMZ组、替莫唑胺 (temozolomide，TMZ) 组、卡莫斯汀 (BCNU) 组和不载药微球 (P-0) 组，然后将P-TMZ (500 mg/kg)、TMZ (50 mg/kg)、BCNU (40 mg/kg) 和P-0 (500 mg/kg) 以DMEM培养液混悬至终体积150 μl，经皮多点穿刺缓慢注入相应组肿瘤间质内，每周测量皮下肿瘤大小2次。 结果 P-TMZ、TMZ和BCNU对SHG-44胶质瘤细胞的体外抑瘤效果明显，三者的IC50均<10μg/ml;与P-0组比较，差异均具有统计学意义 (P <0.01)。在体内抑瘤实验中，P-TMZ、BCNU、TMZ抑瘤率均明显高于P-0 (P <0.01)。P-TMZ和BCNU的抑瘤效应优于TMZ组 (P <0.05)。 结论 P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性，兼具高稳定性和长时程药物作用时间等药代动力学特征，为胶质瘤病人肿瘤残腔内间质化疗提供了新的治疗选择。

【关键词】 神经胶质瘤 替莫唑胺 迟效制剂 药物疗法

替莫唑胺 (temozolomide，TMZ) 因其明确的抗胶质瘤疗效，且口服易吸收，生物利用度高，脂溶性好，可通过血-脑屏障而无明显的不良反应受到青睐[1]。本研究将聚双碳苯氧丙烷癸二酸 (PCPP-SA) 包被TMZ制成缓释微球 (P-TMZ)。P-TMZ能缓慢释放药物，并能达到有效抑瘤浓度，作用时间长、毒副作用小，较适合作为肿瘤间质内的化疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株和主要试剂： 国人脑胶质瘤体外细胞系SHG-44为本实验室自建;DMEM培养基 (美国Gibco公司)，小牛血清 (FBS，杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑蓝 (生工生物工程有限公司)。

1.1.2 P-TMZ的制备[2]： 先将TMZ喷成直径1 μm的小球，然后悬浮于PCPP-SA高分子溶液中，由于小球粒径较小，因此在搅拌过程中不会沉降。将悬浊液再进行喷雾干燥，从而回收得到载药微球。微球中TMZ含量为10%，平均粒径7.3 μm。微球经60Co照射灭菌后于-70 ℃冰箱中保存备用。P-0为不含TMZ的空白微球。TMZ由天津天士力集团制备，BCNU购于天津氨基酸公司人民制药厂。

1.1.3 实验动物[3]： NC系裸小鼠为本实验室从日本国藤田保健卫生大学实验动物中心引进，饲育在NASA1000级生物净化室，按SPF级要求管理，动物合格证号为SYXK (苏) 2007-0035，实验用鼠为6~8周龄，体质量20~24 g，雌雄兼用。

1.2 实验方法

1.2.1 体外抑瘤实验： SHG-44人脑胶质瘤细胞系复苏后接种于含有10%小牛血清的DMEM培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下温箱培养。将细胞以1 × 104/ml浓度接种于96孔板，每孔100 μl，并设立3个加入完全培养基的调零孔。待细胞贴壁24 h时，分别加入不同浓度的P-TMZ、TMZ、BCNU和 P-0，各药物均用培养液混悬，每孔加入100 μl，至终浓度分别为1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml，每个浓度均设5孔重复，然后置于培养箱中继续培养。加药后96 h采用MTT法检测抑瘤率，测定570 nm 的OD值，比较P-TMZ、TMZ、BCNU和P-0相对于空白对照组 (仅加入DMEM培养基) 对胶质瘤细胞的抑制率。

1.2.2 裸小鼠皮下移植瘤模型的建立和实验治疗：

以SHG-44胶质瘤细胞 (1 × 107) 接种于裸小鼠右腋皮下，致瘤后以组织块移植传代，4代后生物学特征稳定 (致瘤率100%，生长速度差异很小)[4]。将皮下移植瘤以无菌技术取出剪切后按2 mm3/鼠接种于裸鼠右腋皮下，待肿瘤生长至体积约100 mm3时，将荷瘤鼠随机分为4组：P-TMZ组、TMZ组、BCNU组和P-0组，每组7只。以TMZ、BCNU为阳性对照组，P-0为阴性对照组。用药剂量为TMZ 50 mg/kg，含10% TMZ的P-TMZ 500 mg/kg，BCNU 40 mg/kg，然后分别将P-TMZ、TMZ、BCNU和P-0 (500 mg/kg) 以无血清培养基混悬至终体积150 μl，经皮多点穿刺缓慢注入肿瘤间质内。用药后1周2次测量体质量、肿瘤短径a和长径b，根据下列公式计算肿瘤体积W = a2 × b/2。28 d为1个TMZ治疗周期，末次测量后处死小鼠，取出肿瘤组织称量质量。计算肿瘤抑制率，评价疗效。肿瘤抑制率 = (对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重 × 100%

1.3 统计学分析 用SPSS13.0软件对肿瘤的体积和荷瘤鼠体质量行方差分析。

2 结 果

2.1 P-TMZ的制备 P-TMZ测得的样品各项指标为：喷雾干燥回收率80%，包封率103%，载药量10.3%，平均粒径7.3 μm (图1)。将该微球50 mg放入透析袋中，再装入含50 ml PBS缓冲液的三角瓶中，放入摇床，进行体外释放实验，以高效液相色谱 (HPLC) 中峰面积来计算载药微球的释药量。释药过程的动力学曲线显示微球经21 d后基本释药完全。P-TMZ体外释放时间可达3周，第1天有一定的突释现象，随后渐趋平缓，24 h释放量在10%左右，72 h在20%左右，2周后超过90%，50%的药物释放时间为6~7 d。Higuchi方程以累计释放量Q对释放时间t1/2作图近似呈直线，符合长效制剂特征。

2.2 体外抑瘤实验 (图2) MTT实验结果显示：随着药物浓度的增加，对肿瘤细胞的抑制率也逐渐升高;随着药物作用时间的延长，抑瘤率也在增加。P-TMZ、BCNU和TMZ三者的IC50分别为 (6.63 ± 0.263) μg/ml、(7.98 ± 0.244) μg/ml、(8.41 ± 0.264) μg/ml，IC50均<10 μg/ml，对SHG-44胶质瘤细胞的杀伤效果明显，明显优于P-0，后者IC50=(34.1 ± 2.80)μg/ml，P <0.01。P-TMZ的作用优于BCNU和TMZ，当药物的浓度<10 μg/ml时，TMZ的抑瘤作用优于BCNU;当药物浓度>10 μg/ml后，BCNU的疗效超过TMZ。

2.3 P-TMZ对皮下接种肿瘤的抑瘤效应 荷瘤鼠治疗前体质量为 (22.20 ± 0.95) g，治疗结束后为 (28.06 ± 0.69) g，其中P-TMZ组 (28.66 ± 0.55) g，BCNU组 (27.28 ± 0.51) g，TMZ组 (28.88 ± 4.35) g，P-0组 (27.23 ± 2.84) g。各组治疗开始与结束后体质量变化与同龄饲养鼠无明显差异，未见体质量减轻等不良反应。各组间裸小鼠体质量无明显的统计学差异 (P >0.05)。间质内化疗期间各实验组肿瘤体积变化，显示用药1周后P-0组 (阴性对照) 肿瘤生长明显快于P-TMZ、BCNU、TMZ等各治疗组，并持续呈指数倍增长。治疗18 d内P-TMZ组、BCNU组和TMZ组肿瘤生长速度维持于较低水平，18 d后 TMZ组肿瘤生长明显加速，持续快速增大，高于P-TMZ组和BCNU组 (P <0.05)。化疗28 d结束，显示P-TMZ对皮下移植瘤的抑制率明显高于TMZ (图3，表1)。

3 讨 论

胶质瘤具有易复发的特点，间质内缓释化疗作为一种手术和传统放化疗的有效补充手段，受到了广泛关注。将局部缓释化疗药物直接植入肿瘤残腔，由于能在局部保持长时间、稳定连续的高浓度作用，而在血、其他组织和正常脑组织中的药物浓度很低，这样可提高药物的治疗效果且将副作用减到最低，并避免了非缓释药物要经常给药所带来的不便，具有更好的应用前景。临床研究表明：术后间质内给予缓释型BCNU，能显著延长胶质瘤病人的中位生存时间[5-7，12];据此研发的BCNU缓释片Gliadel Wafer (美国MGI制药公司) 已在欧美应用。缓释药物植入大脑内，植入侧的药物浓度比对侧高6~70倍[8]。Zhang等[9]在体外研究中发现缓释微球中TMZ逐渐释放，可增强TMZ对C6大鼠脑胶质瘤细胞的抗肿瘤效应。

近年，第二代烷化剂替莫唑胺 (咪唑四嗪类化合物) 为脂溶性物质，具有良好的血-脑屏障通过率[10]，且不良反应率低，抑瘤效应明显，在临床上广泛应用。PCPP-SA是一种无毒可生物降解的聚酸酐类聚合物，由癸二酸 (SA) 和1，3-双 (对羧基苯氧基) 丙烷 (PCPP) 的预聚酸酐聚合而成的共聚物，共聚比例为SA∶PCPP = 80∶20。在众多的可降解多聚物中是应用比较成熟的一种，它属于高分子可吸收材料，具有很好的生物相容性;PCPP-SA在体内能够完全生物降解，其中SA单体最终分解为CO2，CPP则以原型从尿中排除[11]，因此，P-TMZ在药物释放的过程中，微球也在逐渐降解，不会在脑内积聚;该多聚体能使药物释放平稳、浓度稳定，释放时间可通过PCPP和SA的比例搭配来调控，已有报告证实恶性人脑胶质瘤术后肿瘤残腔内植入以PCPP-SA为囊材制备的BCNU缓释片能延长病人的生存期限[12]，因此，我们采用PCPP-SA作为囊材来制备TMZ缓释微球。该微球中TMZ含量为10%，药物微球直径平均为7.3 μm，药物释放时间可达21 d，根据临床需要以微球混悬液形式注入瘤内，亦可将微球聚合成薄片贴敷于肿瘤残腔，达到原位抑制肿瘤的效果。P-TMZ用于胶质瘤间质内植入化疗是较理想的选择。

在体外抑瘤实验中，TMZ对肿瘤细胞的抑制率不及P-TMZ，其原因与TMZ在细胞培养液中不稳定易于降解有关，这也提示药物在口服吸收至进入血、组织液等过程中，在与细胞培养液较接近的生理条件下，组织液中TMZ的降解失效率偏高，只能靠增加药物剂量和用药频次，以期达到药物有效的抑瘤浓度和剂量。
Zhang等[9]报告TMZ在12 h内丧失抗肿瘤的作用。本研究发现：P-TMZ在体外对肿瘤细胞有明显的抑制效应，从低浓度到高浓度，抑瘤效果均好于TMZ和BCNU。这说明在TMZ被包裹后，P-TMZ不仅可以使TMZ缓慢释放达到有效的抑瘤浓度，而且可以保护TMZ不被破坏、延长药物作用时间。在体内抑瘤实验中，P-TMZ以500 mg/kg的剂量 (含TMZ 50 mg/kg)，取得显著抑瘤效应 (P <0.01)，且与相同剂量的TMZ相比，抑瘤效果优于后者 (P <0.05)，提示其在肿瘤局部的高效低毒抑瘤效应。因此，术中切除肿瘤后于肿瘤残腔原位应用P-TMZ片敷贴瘤腔壁，或在术后通过留置于肿瘤残腔的外引流管注入P-TMZ微球，在结合放射治疗和术后TMZ口服制剂实施同步放化疗，将有望提高胶质瘤的疗效。