Effects of nerve growth factor on apoptosis of sensory neurons after injury of themandibular branch of trigeminal nerve
许 波,杨 军 (第三军医大学附属西南医院口腔科,重庆400038)
三叉神经损伤临床较为常见,本研究通过建立动物模型,探讨外源性NGF 对三叉神经下颌支损伤后感觉神经元细胞凋亡及凋亡相关因子Bcl22 及Bax 的影响,以期寻求一种更为理想的周围神经缺损的修复方法提供理论依据。
1 材料和方法
1. 1 动物分组及模型建立
健康雄性成年Wistar 大鼠120 只,体重250～300 g(第三军医大学实验动物中心提供) 。分为三大组,每组6 只,正常对照组, 左侧三叉神经下颌支离断后单纯吻合组,左侧三叉神经下颌支离断后吻合+ NGF 组(NGF组) 。
大鼠经1 %戊巴比妥钠(50～60 mg/ kg) 腹腔注射麻醉后,备皮、消毒,切开左侧下颌下缘皮肤、肌肉,骨膜,掀起颊侧软组织瓣,显露下颌骨,找出下齿槽神经血管束。去除下颌骨下1/ 3颊侧骨板,显露下齿槽神经血管。在手术显微镜下,仔细分离下齿槽神经。自颏孔向后约6 mm 处切去下齿槽神经6 mm ,任其回缩。神经离断后0、3、7 d 用14 mm长的硅胶管(内径115mm ,外径210 mm) 桥接,9 个0 无损伤尼龙线穿过神经断端外膜,两端分别套入管内2 mm并固定于管壁上,对左侧下齿槽神经造成10 mm缺损。同时管内注射NGF(中国军事医学科学院
基础医学研究所提供) 溶液(1 mg/ L) 30μl 或等量的生理盐水。术后分别饲养15 d ,30 d。各组动物饲养至所需时间后用4 %的多聚甲醛灌注取材。
1. 2 取材、固定、初步处理及切片
方法参照文献[1 ] ,取材于三叉N 感觉核区,沿大脑脚盖中部靠外侧(前囟后9168 mm ,中线旁0168 mm) ,行冰冻冠状连续切片(10μm) ,切片置于- 20 ℃冰箱中保存以备用。
1. 3 观察方法
1. 3. 1 原位末端标记法(Terminal deoxycleotidy12transferase2medi2ated dUTP2biotin nick end labeling TUNEL) 标记凋亡细胞
TUNEL 法试剂盒购至博士德公司(MK 1 020) ,操作参照说明书进行,在×100 普通光镜下观察感觉核区内TUNEL 阳性细胞形态。
1. 3. 2 免疫细胞化学法检测凋亡相关因子Bcl22 及Bax 免疫细胞化学法检测试剂盒购至博士德公司(MK 1 102) ,操作参照说明书进行,在×100 倍普通光镜下观察感觉核区内Bcl22、Bax 表达。
1. 3. 3 图像分析及统计学分析 取各实验组不同时相点感觉核区内阳性细胞数量进行统计,比较各组TUNEL 阳性细胞数量以及Bcl22、Bax 表达量的差异。数据采用方差分析。
2 结果
2. 1 NGF 对凋亡细胞数量的影响
凋亡的神经元细胞经TUNEL 法染色胞核呈黄褐色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。细胞核中有棕黄色颗粒,胞质不着色者为阳性细胞(凋亡细胞) 。软件图像灰度比分析结果显示,与正常对照组相比,单纯吻合组与NGF 组的神经元凋亡数都明显增加,但0 d、3 d 吻合的NGF 组凋亡数明显少于单纯吻合组( P < 0101) ,而7 d 吻合NGF 组细胞凋亡数与单纯吻合组无明显差异( P > 0105) 。
2. 2 NGF 对Bcl22 及Bax 的影响
免疫细胞化学显示,Bcl22 及Bax 在正常成年大鼠三叉神经感觉神经元中表达很低,仅见少量免疫反应可疑阳性细胞,细胞着色很淡。与正常对照组相比,单纯吻合组与NGF 组的神经元细胞Bcl22 及Bax 的表达不同程度地增高,NGF 组中Bcl22的表达明显高于单纯吻合组( P < 0101) 而单纯吻合组中Bax 的表达明显高于NGF 组( P < 0101) 。
3 讨论
在中枢神经系统发育过程中,神经损伤所导致的神经元变性和坏死可引起轴突再生的失败,这可能与损伤引起的神经元凋亡有关。研究发现神经生长因子(NGF) 与神经细胞凋亡的关系十分密切[2 ] ,其生物学作用不仅表现在可阻止神经元发育过程中凋亡的发生,同时对调节神经元的连接也有重要的作用。但是关于NGF 对三叉神经损伤后感觉神经元细胞的凋亡是否具有抑制作用目前尚未见报道。
本研究发现NGF 可以抑制损伤后三叉神经感觉核神经元细胞的凋亡,结果同时显示,7 d 吻合加NGF 组与单纯吻合组的神经元凋亡数无明显差异,提示神经损伤后尽快恢复神经的连续性及轴浆运输通道是十分必要的。
人们在凋亡的分子生物学研究中还发现,凋亡与胞核内某些基因有关,Bcl22 家族是研究较早的与凋亡有关的基因。B 细胞淋巴瘤/ 白血病22 (B2cell lymphoma/ leukemia22 , Bcl22) 中有的称为抑凋亡基因,如Bcl22 ;有的则称为促凋亡基因,如Bax。这些基因家族成员自身或彼此之间形成二聚体/ 多聚体。Bcl22家族的蛋白2蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡,核心是Bcl22 与Bax 的相互作用[3 ] 。有实验表明[4 ] ,在节状神经元中Bcl22 的抗凋亡效应完全依赖Bax 的存在;而在三叉神经元中Bcl22 的抗凋亡效应并不依赖Bax 的存在,从而说明Bcl22 的抗凋亡效应或是通过抑制其他促凋亡蛋白来发挥或是由Bcl22 直接抑制死亡效应蛋白所致。本实验结果表明三叉神经损伤后,局部给予外源性NGF 可使抗凋亡基因Bcl22 和促凋亡基因Bax均增加,但Bcl22 更加显著,这样Bcl22 与Bax 的相对比例增加,从而抑制凋亡,这与有的学者研究结果一致。
综上所述,本实验结果显示,三叉神经下颌支损伤后,在尽早恢复神经的连续性的同时局部早期予以外源性NGF ,可更加明显地减少神经元的凋亡,有效地促进神经元的结构和功能的恢复。但目前关于NGF 调节神经细胞凋亡机制尚未完全阐明,还有许多未知调控因素以及相关基因对细胞凋亡的调控机制有待于进一步深入研究。
参考文献:
[1 ] 蔡文琴,王伯氵云主编. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M] . 成都:四川科学技术出版社,1992. 128.
[ 2 ] Derby A , Engleman V W, Frierdich G E , et al . Nerve growth factor facili2tates regeneration across nerve gaps : morphological and behavioral studies inrat sciatic nerve[J ] . Exp Neurol ,1993 ,119 (11) :176 - 191.
[3 ] Merry E , Korsmeyer SJ . Bcl22 gene family in the nervous system[J ] . An2nu Rev Neurosci ,1997 ,20 (3) :245 - 257.
[4 ] LindenboimL , Yuan J , Stein R. Bcl2xS and Bax induce different apoptoticpathways in PC12 cells[J ] . Oncogene ,2000 ,19(14) :1 783 - 1 793.
(编辑 陈聪连)