【摘要】
目的:探讨蛇毒神经生长因子(NGF) 对人肿瘤细胞增殖的抑制作用。
方法:采用噻唑蓝(MTT) 法、台盼蓝拒染法和集落形成作为观察指标,以NGF 5 ,10 ,15 ,20μg / ml 处理4 种人肿瘤细胞(人白血病细胞株K 562、人胰癌细胞株JF 305 ,人肺癌细胞株AGZY283a 和人胃癌细胞株MG2803) ,选用不同作用时间,分别观察NGF 对上述细胞的影响。阿霉素(Adr) 为阳性对照药。
结果:NGF 对4 种人肿瘤细胞均有细胞毒性作用,K562 和JF 305 比后两者显示出更好的量效关系( P 均< 0. 05) 。NGF 处理24 ,48 和96 h 后K 562 和JF 305 细胞的生长均受到抑制( P < 0.05 , P < 0. 01) 。并有显著的剂量效应关系。处理JF 305 细胞24 ,48 和96 h ,NGF 的半抑制浓度( IC50) ,时间2效应关系亦明显;NGF 对K562 细胞的生长抑制作用以48 h 为显著。NGF 还可显著抑制JF 305 细胞的集落形成,并有明显的量效关系( P < 0. 01) ,其IC50为12. 86μg/ ml 。
结论:NGF 对4 种人肿瘤细胞均具有细胞毒性和生长抑制作用,对K562、JF 305 作用更显著。
In vitro experimental study of the antitumor potency of snake venom nerve growth factor
【Abstract】 Objective : To observe the inhibitory effects of nerve growth factor(NGF) on human tumor cell lines. Meth2
ods :The MTT colorimetric method , trypan blue exclusion ,and colony formation was used. Adr used as positive control. Four kinds
of human tumor cell lines , K562 ,JF 305 , AGZY283a and MG2803 were treated with NGF at different final concentrations of 5 ,
10 ,15 , and 20μg/ ml. The effects of NGF on the cells mentioned above were observed at different intervals after the cell were ex2
posed to NGF.
Results :NGF had obvious cytotoxicity on these cell lines. There were obvious dose2response relationship in test of
K562 and JF 305 cells ( P < 0. 05) . K 562 and JF 305 were exposed to NGF at different intervals of 24 ,48 , and 96 h , the
growth of both cell lines was inhibited obviously and the dose2response relationships were showed distinctively. At 24 , 48 , and 96
h intervals after JF 305 cells were exposed to NGF ,there was obvious time2reponse relationship. The inhibitory effect of NGF on
the growth of K562 reached peak at 48h time point. NGF also possessed inhibitory effect on colony formation of JF 305 cells with
satisfied dose2response relationship ( P < 0. 01) and the IC50 was 12. 83μg/ ml. Conclusion :NGF possesses distinct cytotoxicity
and growth inhibitory effect on the four kind of human tumor cells especially on K562 and JF 3051
肿瘤是危害人类健康的严重疾病,近年来,利用我国动物资源开发新的抗肿瘤药物,成为肿瘤研究领域的重要内容。蛇毒神经生长因子(nerve growthfactor , NGF) 抑瘤作用,国内尚未见报道。我们观察蛇毒抗肿瘤有效成分对4 种人肿瘤细胞的作用,报告如下。
1 材料与方法
111 材料
11111 细胞:人白血病细胞株K 562 ,人胰癌细胞株JF 305 , 人肺癌细胞株AGZY283a ,人胃癌细胞株MG2803。除K 562 细胞为悬浮生长,其余3 种细胞均贴壁生长,培养于含5 %胎牛血清的RPMI 1640 培养基中(内含青霉素100 u/ ml ,链霉素100 u/ ml) 。细胞在含5 % CO2 的37 ℃培养箱中培养,每2 d 传一代,细胞株由本实验室提供。
11112 药品与试剂:NGF 的分离采用常规层析方法进行分离,高效液相色谱(HPLC) 法分析检测蛇毒的分离效果,经冷冻干燥后- 30 ℃保存,实验前用生理盐水稀释成所需浓度。盐酸阿霉素(adriamycin ,Adr)为意大利普强公司生产市售冻干粉剂,使用前用RPMI 1640 稀释。
11113 细胞毒实验:采用噻唑蓝(MTT) 法[1 ] 。贴壁生长的肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后,制成含细胞1.0 ×105/ ml 单细胞悬液,分别接种于无菌96 孔培养板中,每孔反应总体积200μl ,设空白对照组(加等体积RPMI 1640) 、阳性对照和NGF 组,每组4 个重复孔。NGF 处理MG2803、AGZY283a 、JF 305 和K 562细胞时选用4 个浓度5 ,10 ,15 ,20 μg/ ml ,Adr (0. 25μg/ ml) 为阳性对照,细胞置37 ℃培养48 h。实验终止前4 h 加入MTT 20μl (5 mg/ ml) 继续培养4 h ,弃上清液,加入二甲基亚砜(DMSO) 100μl/ 孔,用酶标仪于波长570 nm 处测定A570值,按下列公式求出生长抑制率( IR) :IR( %) = (1 - 用药组A570值/ 对照组A570值) ×100
11114 生长抑制实验:采用台盼蓝拒染法。4 种肿瘤细胞实验分组及给药浓度同细胞毒性实验。NGF处理细胞24 ,48 ,96 h 计数拒染活细胞数,计算IR 和半抑制浓度( IC50) 。
11115 集落形成实验:按文献[ 2 ]方法取JF 305 细胞每孔1 ml (600 cells/ ml) ,接种于12 孔板,每孔再加入1ml 培养液,实验分组及给药浓度同细胞毒实验。于37 ℃,5 % CO2 温箱中静置培养24 h 后,各组加入相应药物,培养4 h ,用D2Hank 液洗3 遍,更换新鲜培养液(2 ml/ 孔) 静置培养7～10 d。在×20 解剖镜下计数含50 个细胞以上的集落,计算集落形成抑制率( IR) 及IC50 。
112 统计学分析 OD 值采用F 检验和q 检验,集落形成采用χ2 检验,将细胞数与OD 值、剂量效应做直线回归与相关性分析,相关系数用t 检验。
2 结果
211 NGF 对人肿瘤细胞的毒性作用 NGF 处理4种肿瘤细胞后,细胞代谢MTT 的能力下降,细胞毒性反应明显。其对AGZY283a 、MG2803 细胞毒性的剂量效应关系不明显,NGF 对K 562 ,JF 05 两种细胞显示出更好的剂量效应关系,相关系数r 分别为0. 9726 和0. 9768 ( P 均< 0. 05) , IC50分别为12. 64μg/ ml 和12. 68μg/ ml ,见表1。
212 NGF 对人肿瘤细胞生长抑制作用 K 562 ,JF305 细胞经NGF 处理24 ,48 ,96 h 后,生长明显受抑制,剂量效应关系显著,相关系数r 在24 ,48 和96 h分别为0. 9823 ,0. 9726 ,0. 9789 和0. 9769 ,0. 9836 ,0.9806 ( P均< 0. 05) 。IC50分别为17. 89 ,10. 60 ,13. 42μg/ ml 和18. 25 ,4. 36 ,9. 10μg/ ml 。对K 562 细胞的生长抑制作用以48 h 为显著,96 h 时效应不增强,JF305 细胞生长抑制效应随NGF 作用时间的延长而增强。见表2(略)。
2. 3 NGF 对JF 305 细胞集落形成抑制作用 NGF浓度> 10μg/ ml 时,JF 305 细胞的集落的形成能力明显降低( P < 0. 01) 。IR 随NGF 浓度的增高而升高,直线回归方程为Y = - 0. 026 + 0. 046 X ( r =0. 9808 , P < 0. 05) ,剂量效应关系显著,IC50为12. 86μg/ ml 。见表3(略)。
3 讨论
在抗肿瘤药物筛选和研究中,体外肿瘤细胞培养和动物实验居重要地位[2 ] 。采用体外细胞培养方法筛选抗肿瘤药物时,检测的终点指标包括细胞的生存能力和生长能力检测两个方面,前者的检测常采用MTT 法,后者的检测常采用集落形成能力实验、细胞计数、蛋白质或其它大分子物质含量测定等。两者结合能客观地反应被测物质的药理作用。本实验应用4 种人肿瘤细胞系采用体外培养的方法,全面观察NGF 的抗肿瘤作用。国外已报道NGF对一些神经和非神经肿瘤,如前列腺癌、肺癌、乳腺癌的抗肿瘤作用。结果显示NGF 可发挥抑制有丝分裂和生长作用(依赖于细胞类型) 。例如NGF 诱导肿瘤细胞生长和侵入,而在人类小细胞癌,NGF 可抑制癌细胞的增殖,阻止它们的克隆生长,在体外可削弱它们的入侵能力,在裸鼠则消除其肿瘤生长能力[3～6 ] ,有报道认为,NGF 可以抑制一些胰癌细胞系的入侵[7 ] 。本实验结果表明,NGF 在所用剂量范围内(5～20μg/ ml) 对MG2803 ,AGZY283a 、JF 305、K 562细胞均有细胞毒作用,细胞经NGF 处理后活细胞数减少,代谢MTT的能力下降,细胞生长受到抑制,克隆形成能力下降。并显示与NGF 的浓度和作用时间均有依赖性,说明NGF 具有一定的抗肿瘤作用。
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