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李瑛 石廷章 赵卫红
摘 要：目的 探讨泰素帝诱导人肺腺癌细胞凋亡的作用机制。方法 应用形态学方法、流式细胞术(FACS)、DNA凝胶电泳、Annexin v标记等方法检测细胞凋亡的发生，应用RT-PCR检测凋亡相关基因 fas、bcl-2、c-myc表达的变化。结果 泰素帝对人肺腺癌细胞系 a549细胞的生长有明显的抑制作用，使细胞分裂阻滞于G2M期，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质聚集或断裂，DNA凝胶电泳显示清晰的DNA梯形条带，FAGS检测在G1期之前出现 sub-G1峰，凋亡率最高为 15.69%，Annexin V标记的方法检测凋亡时发现，坏死和凋亡共存。在泰素帝诱导 a549凋亡的过程中，凋亡相关基因 Fas转录水平比用药前增强，bcl-2和c-myc无明显变化。结论 除了坏死，凋亡也为泰素帝抑瘤的机制之一。泰素帝诱导 a549凋亡可能主要与促进 Fas基因表达有关。
主题词：肺肿瘤；腺癌；泰素帝；细胞凋亡；Fas基因
泰素帝是 1986年由法国罗纳普朗克*乐安公司首先生产的一种半合成抗癌新药。其结构类似紫杉醇，是从欧洲紫杉针叶提取加工的，有促进细胞微管聚合、抑制微管解聚的作用，使细胞不能进行正常的有丝分裂。泰素帝的来源较紫杉醇更易获得，对某些肿瘤的杀伤作用是紫杉醇的2倍，并且对某些过度表达P-糖蛋白的耐药细胞株仍然有效［1］。经多年的临床研究结果表明，其对多种癌症有效，特别是对转移性乳腺癌和晚期非小细胞癌［2］。在白血病和乳腺癌细胞的体外实验研究中，已经发现泰素帝的细胞毒性与其诱发细胞凋亡的作用有关［3，4］。泰素帝作为治疗非小细胞肺癌最有前景的新药［5］，体内外实验均显示，对非小细胞肺癌有生长抑制和杀伤作用，但尚未见泰素帝诱导肺癌细胞凋亡的报道。我们选择人肺腺癌株 a549来探讨泰素帝诱导凋亡发生的比例及机制，为泰素帝临床应用提供理论依据。
材料与方法
一、材料
人肺腺癌细胞系 A549购自解放军总医院肿瘤生物研究所。泰素帝为法国罗纳普朗克*乐安公司提供。bcl2引物扩增产物为170 bp，c-myc 为170 bp, Fas 为190 bp，β-actin (内标)为 450 bp。
二、方法
1.细胞培养： A549用含 10%小牛血清 RPMI 1640 培养基，在37℃、5% cO2饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞。
2.形态学观察：细胞悬液离心涂片，瑞氏染液染色 5 min，光镜下观察。
3.电镜观察：收集 106细胞，离心后以 3%戊二醛固定24 h，1% OsO4固定2 h，常规脱水、包埋、聚合、切片、染色。
4.DNA 凝胶电泳：采用卢圣栋［6］的快速法提取 dNA。细胞悬液溶于 DNA提取液1中，加入 NP-40，混匀后离心弃上清；沉淀加入 dNA提取液 2及6 mol/L NaCl，混匀后离心取上清，用乙酸铵、冰乙醇沉淀 dNA；沉淀物溶于 TE缓冲液；经1.8%琼脂糖凝胶电泳。
5.流式细胞仪分析：经流式细胞术(FACS)常规预处理细胞后上机测定细胞周期分布及凋亡率，以未加药者为对照组。
6.Annexin V标记：使用 Boehringer Mannheim 公司试剂盒 annexin-V-flous。收集 106/ml 细胞，加入 200 μl工作液，室温下10～15 min后上机检测。
7.RT-PCR：首先提取 RNA，收集 107细胞加入 200 μl裂解液及氯仿，离心取上层水相；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(24∶24∶1)，离心吸取上清；加入醋酸钠和异丙醇，-20℃放置20 min，离心弃上清，室温晾干。然后进行反转录反应，样品加入15 μl RT液，1 μl 酶混合离心数秒，42℃水浴 30 min。最后进行 pCR反应，加入 PCR液 20 μl，1 μl Taq酶，1滴石蜡油，离心数秒，上机进行 pCR循环；变性 94℃ 45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 45 s，共35个循环。经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察照相。
8.统计分析：均采用 6.04版 SAS软件，进行统计分析。
结果
1.细胞形态学变化：0.1μmol/L泰素帝作用于A549 72 h时，光镜下观察有10%～20%细胞出现固缩，细胞核染色质聚集，断裂成数个圆形颗粒，胞膜仍完整。电镜下可见细胞体积变小，胞浆凝缩，内质网疏松与胞膜融合成一个个空泡，核内染色质凝聚成新月状附着于核膜边(图1)。以上形态改变表明，A549在泰素帝诱导下出现了细胞凋亡。另有部分肿胀细胞，胞膜已破碎，细胞器崩溃，染色质疏松为坏死细胞。
当泰素帝剂量加大时，则花团样多核细胞更多，肿胀破裂的坏死细胞比例更大，而核固缩的凋亡细胞并未增多。
2.DNA 凝胶电泳分析：0.1 μmol/L泰素帝作用于 A549 72 h始出现梯形条带，在(0.01～10)μmol/L 范围内作用 72 h均出现凋亡特有的梯形条带，但当剂量加大至10μmol/L时，其背景夹杂有坏死的膜状改变(图2)。
3.流式细胞术(FCM)：经 FCM进行周期检测，泰素帝 0.1 μmol/L作用12 h已有明显的G2M阻滞；当 1 μmol/L作用 48 h时，G2M期细胞高达80.01%。第3天以后，由于部分阻滞的细胞发生死亡，使G2M、G1、S期细胞均相应减少，Sub-G1期细胞增多。亚二倍体峰 sub-G1峰的面积代表凋亡细胞的比例(apo%)。泰素帝 0.1 μmol/L作用 A549 72 h的 apo%最高为15.69%，其他浓度时间的 apo%均低于此值。
C：A549对照组；1～4：0.01，0.1，1.0，10μmol/L泰素帝作用72 h组；Mr：PBR 322BstN1图2 DNA凝胶电泳结果
4.Annexin-V-flous标记：磷脂酰丝氨酸(phosphatidylscrine, pS)正常时分布于细胞膜内，细胞发生凋亡早期便从膜内翻转至膜外。Annexin v在Ca2+存在时可以和PS特异结合，故 Annexin V试剂盒可作为检测凋亡的早期手段，且较敏感［7］。结合碘化丙啶(PI)染色，可将细胞分为4种属性：Ⅰ象限：PI高染，异硫氰酸荧光素(FITC)低染，为坏死细胞；Ⅱ象限：PI、FITC均高染为凋亡后坏死细胞及部分坏死细胞；Ⅲ象限：PI、FITC均低染为正常细胞；Ⅳ象限：PI低染，FITC高染，为凋亡细胞。因Ⅱ象限由凋亡后坏死细胞和部分坏死细胞两部分组成，无法区分，故除了对Ⅰ和Ⅳ象限分别进行凋亡和坏死的粗略统计外，还应考虑Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ象限的数值(表1)。
泰素帝0.1 μmol/L作用于A549 24h，坏死比对照组增加了3.3倍，而凋亡比例不高。第2天坏死比例下降，凋亡比例增加，是第1天的2.4倍，象限Ⅱ(凋亡后坏死和部分坏死)为对照组的 3.8倍。结合象限Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ的数值变化，提示凋亡后坏死占有相当比重。
5.凋亡的相关基因：泰素帝 0.1 μmol/L作用于A549 24 h后，Fas基因转录较用药前增强，而c-myc和bcl-2基因的转录无明显变化(图3)。
表1 泰素帝1.0 μmol/L对A549的annexin V检测
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组别 |
时间
(d) |
细胞百分比(%) |
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Ⅰ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅳ |
Ⅱ+Ⅳ |
Ⅰ+Ⅱ |
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对照组 |
1 |
2.8 |
8.2 |
80.6 |
8.5 |
16.7 |
11.0 |
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泰素帝 |
1 |
12.1 |
17.8 |
66.8 |
3.4 |
21.2 |
29.9 |
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泰素帝 |
2 |
11.6 |
31.4 |
48.8 |
8.2 |
39.6 |
43.0 |
讨论
1.凋亡的检测：本实验采用多方法检测，发现0.1μmol/L泰素帝对人肺腺癌细胞系A549有诱导凋亡的作用，其作用72 h的apo%最高，此浓度为周期阻滞峰值浓度(1 μmol/L)的1/10。另外，凋亡的发生迟于周期阻滞，开始于48 h(即周期阻滞达峰值时)，72 h达峰值后又逐渐下降。即在肿瘤细胞陆续进入 g2M期阻滞后，凋亡的比例也开始增加，提示凋亡的发生可能与周期阻滞有关。体内实验也有类似发现，Ronald等［8］在移植了 mca-4腺瘤的小鼠中观察泰素帝的作用时也发现，瘤细胞在周期阻滞之后发生了凋亡和坏死，但是在鳞癌 sCC-VII，尽管周期阻滞非常明显却没看到凋亡。有关二者的确切关系尚须深入研究。
2.泰素帝诱导凋亡在其抗肿瘤机制所处的地位：泰素帝对周期的阻滞作用已得到公认。本实验除观察到明显的周期阻滞现象外，还发现在 g2M期阻滞后，大部分细胞死亡，死亡方式除了坏死外，还有凋亡，究竟凋亡在泰素帝对A549细胞系的作用中处于什么地位呢?FCM检测其凋亡率最高为15.69%，在实体瘤诱导的凋亡中属中低水平。另外Annexin-V实验看到，坏死从始至终存在，且比例较高；而凋亡则早期比例较低，晚期凋亡细胞和凋亡后坏死细胞才逐渐增多。坏死似乎更占有优势。
体内实验也有类似发现。Ronald等［8］曾报道在移植了各种肿瘤的小鼠实验中，泰素帝可引起明显的周期阻滞以及相当低的凋亡反应(相对紫杉醇来说)，但是泰素帝的疗效与二者均不相关，细胞的溶解坏死被认为是泰素帝杀伤肿瘤的主要方式。
3.凋亡相关基因：Fas为TNF受体超家族成员，主要表达于活化的 t细胞表面，并可表达于多种肿瘤细胞表面，包括造血系统肿瘤和非造血系统肿瘤。其在肿瘤的凋亡反应中起重要作用，在泰素帝诱导A549凋亡的过程中其转录增加。
原癌基因bcl-2是迄今为止功能最明确的细胞凋亡拮抗基因。近年研究发现，泰素帝及紫杉醇等作用于微管系统的药物，由于破坏了微管的完整性，导致 bcl-2磷酸化，从而促使细胞凋亡［9］。本实验中 A549细胞在使用泰素帝后 bcl-2表达并无明显减少，应进一步检测bcl-2家族其他成员和bcl-2的蛋白产物含量有无变化，以判断泰素帝致凋亡是否与bcl-2家族有关。
M：Mark；1：A549对照组；2：泰素帝处理组，每列上侧条带均为β-actin内标图3 0.1 μmol/L泰素帝对A549作用24 h的Fas、bcl-2、c-myc基因检测
c-myc是癌基因中核心蛋白 myc的家族成员，是细胞生长和细胞周期演进的正调控基因。近年研究发现，它也参与凋亡过程，具有双重性。泰素帝诱导A549的凋亡进程中，c-myc转录水平并无明显变化。
通过泰素帝在人肺腺癌A549细胞系的抗肿瘤机制的实验研究，可以看出泰素帝使肿瘤细胞分裂阻滞于G2M期，周期阻滞之后，肿瘤细胞以坏死和凋亡两种方式死亡。其中Fas基因参与了泰素帝诱导A549凋亡的过程，这些都为该药在非小细胞肺癌的治疗应用提供了一定的理论依据。关于凋亡在泰素帝抑瘤机制中的地位，仍需继续广泛和深入的观察研究。
 
图1 经电镜观察的A549细胞用药前后的形态改变。1a:A549未经泰素帝处理；1b：泰素帝0.1μmol/L作用24h，细胞核染色质连聚，为凋亡早期改变。
作者单位：李瑛（100853 北京，解放军总医院肿瘤科)
石廷章（100853 北京，解放军总医院肿瘤科)
赵卫红（军事医学科学院二所）
参考文献
1．Ringel I, Horwitz sB. Studies with RP 56976 (taxotere): a semisynthetic analog of taxol. J Natl cancer Inst, 1991,83:288-291.
2．Bissery MC. Preclinical pharmacology of docetaxel. Eur J Cancer,1995,31A:sl-s6.
3．Rita C, Pui CH, Frederick GB, et al. In vitro cytotoxicity of docetaxel in childhood acute leukemias. J Clin Oncol, 1998,16:907-913.
4．Ferlini C, Scambia G, Distefano M, et al. Synergistic antiproliferative activity of tamoxifen and docetaxel on three oestrogen receptor-negative cancer cell lines is mediated by the induction of apoptosis. Br J Cancer,1997,75:884-891.
5．Miller VA. Docetaxel in the management of advanced non-small cell lung cancer. Semin Oncol, 1998,25(Suppl 8):15-19.
6．卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第1版.北京：高等教育出版社.1993：103.
7．Istvan V, Clemens H, Helga S, et al. A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidyl serine expression on early apoptotic cell useing fluorescein labelled Annexin V. J Immunolgical Methods, 1995,184:39-51.
8．Ronald S, Kathryn A. Lack of correlation between mitotic arrest or apoptosis and antitumor effect of docetaxel. Cancer Chemother Pharmacol,1999,43:165-172.
9．Elizabeth Y, Stanley JK. Molecular thanatopsis: a discourse on the bcl-2 family and cell death. Blood, 1996,88:386-401.
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