【摘要】 
［目的］ 观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对三种脑胶质瘤细胞放射增敏作用。［方法］ 选择适当浓度的COX-2选择性抑制剂Celecoxib进行放射增敏实验，设置单纯放射（R）组和放射+药物（R+D）组，采用集落形成法分别检测Celecoxib对脑胶质瘤SHG-44细胞株，767细胞以及大鼠脑胶质瘤C6细胞株的放射增敏效应，并绘制细胞存活曲线。［结果］ Celecoxib对3种胶质瘤细胞株均显示出放射增敏效应，R+D组与R组相比较，反映放射敏感性指标的SF2、D0.01、D0、Dq均出现下降。其中tSF2=8.315，P=0.014；tD0.01=9.28，P=0.011；tD0=3.985，P=0.058；tDq=3.348，P=0.075。［结论］ Celecoxib在体外实验中可以提高脑胶质瘤的放射敏感性。Celecoxib有可能成为治疗胶质瘤的放射增敏剂。

【关键词】  塞来昔布；COX-2；放射敏感性；胶质瘤

  Radiosensitization of Celecoxib for Glioma Cells

   QIN Song-bing, ZHOU Le-yuan, XU Xiao-ting, et al.

   (The First Affiliated Hospital, Suzhou University, Suzhou 215006, China)Abstract: ［Purpose］ To study the radiosensitization of celecoxib to three strains of glioma cells. ［Methods］ Celecoxib with proper concentration was adapted for radiosensitive experiments for SHG-44 cells, 767 cells and C6 cells. The cells were randomized into two groups, radiation alone group (R), and radiation combined with celecoxib group (R+D). Celecoxib’s radiosensitization was measured by clongenic assay, and survival curve was described. ［Result］ Celecoxib displayed radiosensitizing effect in the three strains of glioma cells. The Value of D0, Dq, SF2 and D0.01 of group R+D was significantly lower than that of group R (tSF2=83.5,P=0.014;tD0.01=9.28,P=0.011;tD0=3.985,P=0.058;tDq=3.348,P=0.075). ［Conclusion］ The COX-2 selected inhibitor, celecoxib could enhance radiation effect in three strains of glioma cells in vitro. Celecoxib might become an effected radiosensitizer in the treatment for glioma.

   Subject words: Celecoxib; COX-2; radiosensitivity; glioma

   脑胶质瘤，尤其是高级别恶性胶质瘤，手术难以全切，术后放疗为其重要的治疗手段，但多数脑胶质瘤对射线不敏感，总体治疗效果并不令人满意，预后不佳[1]，复发率较高。其中肿瘤本身的放射敏感性是影响临床疗效的重要因素，因此探究影响胶质瘤放射敏感性的因素并采取有效措施提高其放射敏感性有着重大的临床意义，有可能对恶性脑胶质瘤的治疗带来积极的作用。

   环氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，存在COX-1和 COX-2两种同工酶，研究表明，COX-2的表达与人类多数肿瘤关系密切，它参与了肿瘤细胞的转化、生长、凋亡过程，同时也参与细胞的运动、转移、肿瘤新生血管的形成[2]。COX-2抑制剂联合化疗药物在对结肠癌、肺癌、乳腺癌的体外和在体研究中取得良好的效果，但对于COX-2抑制剂与放疗联合作用，目前的研究还不多。国外有学者认为COX-2抑制剂具有放射增敏作用，在体外细胞培养和在体移植瘤实验中，均取得了初步的成果，可增敏放射的机制却不甚明了。本实验通过采用COX-2选择性抑制剂Celecoxib（塞来昔布）对3株脑胶质瘤的放射增敏实验，为临床应用COX-2抑制剂作为脑胶质瘤放射增敏剂提供理论上的支持。

   1   材料与方法

   1.1   实验材料与装置

   人脑胶质瘤细胞株SHG-44、767（苏州大学附属第一医院脑研室惠赠），大鼠胶质瘤细胞株C6（上海午立生物技术公司），RPMI-1640培养基（GIBCO公司），小牛血清（杭州四季清公司），二甲基亚砜（DMSO，GIBCO公司），CO2培养箱（上海HERAEUS BB5060型），医用电子直线加速器（SIMENS KD-2型），倒置显微镜（日本OLYMPUS CK-2型），塞来昔布（Celecoxib，商品名：西乐葆，美国辉瑞公司）。

   1.2   实验方法

   1.2.1   细胞培养

   人脑胶质瘤细胞株SHG-44、767，大鼠胶质瘤细胞株C6，所有细胞培养液均为RPMI-1640，含13%小牛血清，青链霉素各100U/ml，NaHCO3调节pH至7.2，培养于37℃，5%CO2浓度，饱和湿度培养箱内。2~3d换液一次，待细胞长满瓶底约80%时0.25%胰酶消化传代。

   1.2.2   集落形成实验

   药物塞来昔布（Celecoxib）用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配置成10mmol/L备用。

   预实验显示，30μmol/L Celecoxib作用于3种胶质瘤细胞72h后，MTT法检测表明对细胞的增殖抑制率不超过20%。故本实验取30μmol/L Celecoxib药物浓度作为增敏研究。

   取上述3株对数生长期细胞，0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，分别接种于六孔板中，分别分成单纯照射组（R）和放射+药物组（R+D），设0、2、4、6、8六个剂量点，计划照射0、2、4Gy的每孔接种150个细胞，6、8Gy的每孔接种750个细胞，接种后6~8h，镜下观察细胞已贴壁后加药，R+D组按30μmol/L药浓度加药，R组加入等量DMSO过夜。次日晨置于KD-2型西门子直线加速器下照射。照射方法：剂量率200cGy/min，射野大小10cm×10cm，细胞表面覆有约1.5cm厚补偿膜，SSD为100cm。细胞接受照射后立刻继续置于培养箱中，培养10~12d后取出，pH 7.2的PBS液冲洗两次，95％酒精固定15min，吸管吸去酒精，晾干，Ｇiemsa染液染色约20min，计数肉眼可见的集落数(大于50个细胞/集落)。每个剂量点设3个平行样本。

   1.3   统计学处理

   细胞存活曲线用曲线拟合软件RADIO MED生成。以线性二次方程S＝e■及多靶单击模型S=1-（1-e-KD）N拟合存活曲线，反映细胞敏感性参数D0、SF2、Dq由软件直接得出，增敏比SER值=单纯照射达到特定生物效应所需照射剂量/照射并用放射增敏剂后达到同样生物效应所需照射剂量。数据统计采用SPSS13.0统计软件，各组细胞参数用x±s，两组间比较采用t检验。

   2   结   果

   2．1   Celecoxib对SHG-44细胞的放射增敏效应

   加入Celecoxib后，SHG-44细胞的D0值从2.57降至1.86，增敏比SER为1.38，Dq值从2.23降至1.74，增敏比SER为1.28（见表1）。加入Celecoxib后SHG-44细胞的存活曲线见图1。

   2．2   Celecoxib对767细胞的放射增敏效应

   加入Celecoxib后，767细胞的D0值从2.59降至1.95，增敏比SER为1.33，Dq值从3.03降至2.13，增敏比SER为1.42（见表2）。加入Celecoxib后767细胞的存活曲线见图2。

   2．3   Celecoxib对C6细胞的放射增敏效应

   加入Celecoxib后，C6细胞的D0值从2.54降至2.28，增敏比SER为1.11，Dq值从2.65降至1.22，增敏比SER为2.17（见表3）。加入Celecoxib后C6细胞的存活曲线见图3。

   2．4   对3种胶质瘤细胞株的R组和R+D组的统计学分析

   对3种胶质瘤细胞株的R组和R+D组的统计分析表明，tSF2=8.315，P=0.014；tD0.01=9.28，P=0.011；tD0=3.985，P=0.058；tDq=3.348，P=0.075，其中用药前后细胞的SF2和D0.01值的变化具有统计学差异。

   3   讨   论

   由于胶质瘤细胞本身辐射耐受性较高，肿瘤组织乏氧以及周围正常脑组织不可能耐受高的辐射剂量。放射肿瘤学家除了在改进放射物理方面进行研究外，同时致力于研究应用放射增敏剂以提高肿瘤控制率。

   塞来昔布由美国辉瑞公司生产，分子量381.38，是一种高效低毒的COX-2选择性抑制剂，于1999年经FDA批准在美国上市，是第一个用于治疗类风湿关节炎和风湿关节炎的COX-2选择性抑制剂，后又作为辅助性用药用于家族性结肠息肉病(FAP)的治疗。本实验采用3种胶质瘤细胞株进行实验，结果显示COX-2抑制剂Celecoxib对于3种胶质瘤均存在着增敏效应。以SF2及D0.01为指标，统计学结果差异显著，而SF2及D0.01都是较小剂量下细胞放射敏感性变化的指标，提示使用Celecoxib对每日常规剂量下提高胶质瘤细胞放射敏感性更有意义。

   COX-2蛋白存在于多种恶性肿瘤及癌前病变中，并且越来越多的研究表明COX-2的表达与肿瘤的分期、恶性程度以及预后密切相关。我们以前的研究表明COX-2表达于人脑胶质瘤SHG-44细胞[3]。由于COX-2在正常细胞表达极少，COX-2选择性抑制剂能够选择性地作用于肿瘤细胞，因此较少引起消化道溃疡，出血及肾毒性等不良反应，与传统的NSAID相比副反应要小得多[4,5]。选择性COX-2抑制剂不仅本身可以抑制肿瘤细胞增殖，而且还增强化疗药物的细胞毒性以及放射敏感性。

   COX-2抑制剂增加了射线对胶质瘤细胞的杀伤作用，与多数文献报道一致。Raju[6]等的离体研究发现10μmol/L、50μmol/L的SC-236（COX-2抑制剂）作用NFSA细胞3天后，在细胞存活率为0.1的水平，增敏因子（EF）分别为1.11和1.51。后者的细胞存活曲线甚至失去了“肩区”，认为抑制了细胞的亚致死性损伤的修复。Petersen等[7]描述胶质细胞瘤U251在SC-236为50μmol/L处理时，其EF值为1.4。Pyo等[8]也报道了NS398（COX-2抑制剂）在离体实验中提高了H460肺癌细胞的放射敏感性。本实验的结果显示，30μmol/L的Celecoxib作用使3株胶质瘤细胞，标志细胞放射敏感性的D0值均有不同程度的减小，增敏比分别为1.38、1.33、1.11；标志细胞放射损伤修复能力的Dq值亦有减小，Dq值增敏比分别为1.28、1.42、2.17，以C6细胞最为明显。可以认为Celecoxib在一定程度上提高了胶质瘤细胞的放射敏感性，同时抑制了胶质瘤细胞的亚致死性损伤的修复，并在多种胶质瘤细胞中具有普遍性。

   放射敏感性与肿瘤细胞表达COX-2蛋白有关。对于辐射敏感的肿瘤COX-2表达水平普遍要低于辐射耐受的肿瘤[9]。COX-2的高表达，必将导致前列腺素E2（PGE2）生成的增多。而PGE2具有放射保护作用，应用COX-2抑制剂将解除这一作用。我们以前的研究表明[3]，辐射还可以诱导COX-2表达的升高，这对于临床上应用的分次放疗具重要有意义。放疗过程中，射线在杀死一定比例肿瘤的同时，存活下来细胞COX-2的表达量上升，导致放射敏感性的下降，这部分细胞很可能成为日后复发的根源。应用COX-2选择抑制剂将抑制这一过程，发挥放射增敏的效应。

   由于Celecoxib是选择性抑制剂，在正常脑组织表达量低，因此对正常脑组织影响较小，并且有报道[10]表明它具有减轻放射性脑损伤的作用。Celecoxib分子量较小，而且辐射可以开放血脑屏障，因此Celecoxib将极有可能成为一个理想的治疗脑胶质瘤的放射增敏剂。

【参考文献】
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[8] Pyo H, Choy H, Amorino GP, et al. A selective cyclooxygenase-2 inhibitor, NS-398, enhances the effect of radiation invitro and in vivo preferentially on the cells that express cyclooxygenase-2[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(10):2998-3005.

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[10] Khan R, Krasin M, Kasow K, et al. Cyclooxygenase-2 inhibition to treat radiation-induced brain necrosis and edema[J]. Pediatr Hematol Oncol, 2004, 26(4):253-255.