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CIK与DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤

2010-04-28 19:46:00 作者：新特药房来源：互联网浏览次数：78 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（DC）联合治疗晚期肿瘤。方法从外周血分离单个核细胞，体外经GMCSF和白细胞介素4(IL4)诱导产生DC细胞，淋巴细胞经干扰素γ（IFNγ ...

【摘要】
目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（DC）联合治疗晚期肿瘤。方法从外周血分离单个核细胞，体外经GMCSF和白细胞介素4(IL4)诱导产生DC细胞，淋巴细胞经干扰素γ（IFNγ）、IL2、CD3单抗和IL1α体外诱导产生CIK细胞，采用流式细胞术检测CIK的表型，并回输患者进行治疗，至少接受3次治疗。结果82例可评价病灶的患者中，3例完全缓解（CR），7例部分缓解（PR）；31例不可评价病灶的患者中，7例患者胸腹水消失，与治疗前相比，治疗后患者CD3+和 CD8+明显升高（P<0.05）。结论CIK细胞治疗晚期恶性实体瘤有一定的临床疗效，为该类患者的治疗提供一种有效的免疫治疗手段。

【关键词】杀伤细胞树突细胞细胞培养的免疫疗法肿瘤

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer,CIK）是以CD3+CD56+T细胞为主要效应细胞的异质细胞群，具有增殖快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，是唯一能激活幼稚T细胞的抗原递呈细胞。DC与CIK共培养可促进CIK的增殖，并加强其功能[12]。为此，本单位自2003年10月～2005年10月将CIK细胞与DC细胞共培养用于145例晚期恶性实体肿瘤患者的治疗，取得较好的近期疗效，现将临床观察结果报告如下。

1对象和方法

1.1对象145例恶性实体瘤患者均经病理证实，男性99例，女性46例，中位年龄52岁（21～83岁）；其中胃癌25例，结直肠癌15例，肝癌、肺癌各20例，鼻咽癌12例，食管癌10例，非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤及肾癌各5例，脑瘤4例，精原细胞瘤及前列腺癌各3例，胸腺瘤、胰腺癌、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤及卵巢癌各2例，宫颈癌1例。

按TNM国际分期法：Ⅲ期88例，Ⅳ期57例；82例有可测量病灶，31例有不可测量病灶（包括胸水和腹水），32例为术后患者；Karnofsky评分≥60分，预计生存期>3个月；治疗前心、肝、肾功能及血常规大致正常；采血前1个月及治疗期间均未接受过放、化疗。

1.2主要试剂Ficoll淋巴分离液（北京军事医学科学院）；鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD56（美国Coulter公司）；rhIL4（英国Pepro Tech公司）；肿瘤坏死因子(TNFα，上海赛达生物药业有限公司)；CD3McAb（武汉生物制品研究所）；干扰素(IFNγ，上海克隆公司)；rhIL2（北京瑞德合通药业有限公司）；GMCSF（北京联合药业有限公司）；RPMI 1640、无血清培养基AIMV（美国Gibco公司）。

1.3肿瘤抗原来源于患者自身手术标本或肿瘤细胞系经超声波粉碎后，10 000 r/min离心×20 min，收集上清为肿瘤组织/细胞裂解物。

1.4方法

1.4.1CIK细胞的制备参照文献[3]。新鲜分离的患者抗凝外周全血100 mL，经Ficoll淋巴分离液梯度离心（500 r/min×15 min），取界面层单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNC），用RPMI1640培养液悬浮细胞，离心（600 r/min×10 min），洗涤细胞3次后，细胞数约为106，用AIMV无血清培养基调整细胞密度为（4～6）×106 mL-1，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养2 h。收集非贴壁细胞，用含人AB血清的完全培养基调整细胞密度约为1×106 mL-1，加入IFNγ 1 000 U/mL，24 h后加入rhIL2 300 U/mL，CD3McAb 70 ng/mL，IL1 10 U/mL，每3 d换液1次，同时补加rhIL2 100 U/mL。

1.4.2DC细胞的培养参照文献[4]。在1.2.3获得的贴壁的PBMNC细胞中加入含GMCSF 1 000 U／mL、rhIL4 1 000 U／mL的AIMV培养基，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养，每3 d换液1次。第3 d将肿瘤抗原加入DC培养液内，第5 d加入TNFα 1 000 U／mL，第7 d将部分负载后的DC按1∶5的比例加入CIK培养液中，共培养5～7 d。

1.4.3细胞增殖动态观察细胞增殖，采用标准白细胞计数方法，计算每毫升中的细胞总数。

1.4.4细胞表型测定收集培养第1 d和第12 d的CIK细胞，PBS洗涤细胞2次，使用不同的抗体组合标记细胞，这些抗体组合为：CD3CY5，CD8PE和CD3FITC，CD56PE，室温孵育20 min后，PBS洗涤细胞2次，流式细胞仪分析。

1.4.5细胞回输收集培养12～14 d的CIK细胞，细胞总数>1012个，600 r/min×10 min离心、洗涤2次后，细胞溶于生理盐水100 mL中，细胞量>1010 mL-1，静脉滴注，3 h内回输患者体内。收集培养7～14 d的悬浮的、经过表型鉴定的成熟DC，溶于1 mL生理盐水中，106 mL-1皮下注射。

1.5疗效评价疗效指标包括客观缓解率（OR）、有效率（RR）和临床受益率（CBR）。

1.5.1可测量病灶的客观缓解率（OR）主要采用CT或胸片、B超测量病灶大小(双径测量)，按WHO规定的评定肿瘤近期疗效标准，即每2个疗程后作评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(SD)和进展(PD)。如初步评价为PR或CR，则于4周后再次评价确认。以4周确认后的CR+PR统计客观缓解率（OR）。

1.5.2不可测量病灶的有效率（RR）胸、腹水消失为有效，如初步评价为有效，则于4周后再次评价确认。以4周确认后的有效病例数统计有效率（RR）。

1.5.3临床受益率(CBR)疼痛程度减轻≥50％并持续>4周，体力状况改善≥20分并持续>4周，体质量增加≥7％，胸腹水减少≥50%但未消失。疗效判定分为：（1）有效：至少符合上述标准中1项，且其他无变化；（2）稳定：全部无变化。

观察患者术后无病生存期（DFS），毒副反应按WHO(1998)统一标准分为0～Ⅳ度[5]。

1.6统计学处理利用SPSS l2.0分析，2组独立样本均数比较采用t检验。

2结果

2.1CIK细胞培养前后淋巴细胞表型分析经流式细胞仪分析表明，CIK属于异质细胞群，随着与DC的共同孵育时间的延长，其表面CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞群的比例明显增加，与培养前比较差别有统计学意义（P<0.01，图1，表1）。

2.2CIK细胞增殖细胞在培养的前3 d数量略有减少，但随后即快速增长，培养第5 d开始倍增，至第12 d，细胞体积明显变大、变形，形状不规则，并呈现母细胞化，成簇生长（图2）。此后每3 d增长2～3倍，至第12 d时细胞数量约为培养前的15倍左右，同时加入DC共同培养的CIK增殖速度更快，至第12 d其细胞数约为未加DC的CIK细胞数的3～4倍。

2.3CIK细胞治疗后患者外周血淋巴细胞表型变化见表2。表1CIK细胞培养前后淋巴细胞表型分析表2外周血淋巴细胞表面标志的变化

2.4DCCIK回输方法及回输疗程DC采用皮下注射，溶于生理盐水1 mL中，106 mL-1，每周1次，至少接受3次治疗。CIK经静脉注射，每周回输3次，每次100 mL，1010 mL-1，4周为1疗程，至少回输3次（1/4疗程），回输最多的120次（10疗程）。

2.5临床疗效及不良反应

2.5.1临床疗效（1）82例有可测量病灶患者可评价OR。3例CR（鼻咽癌、恶性黑色素瘤与结肠癌局部治疗各1例），7例PR（鼻咽癌2例，原发性肝癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌及非小细胞肺癌各1例）。OR为12.2％（10/82）。（2）31例有不可测量病灶胸腹水的患者可评价RR。7例胸腹水消失（有效病例）。RR为22.58%(7/31)。（3）145例患者均可评价CBR：卡氏评分增加≥20分70例（61.95％，70/113）；疼痛减轻≥50％ 25例(40.98%，25/61)；体质量增加≥7％ 52例（46.02％，51/113）；胸腹水减少但未消失15例（48.39％，15/31）。总CBR为50.44％（57/113）。（4）32例术后患者中6例DFS 2年（非小细胞肺癌与结直肠癌各2例，骨肉瘤与乳腺癌各1例），5例>1年（胃癌与肝癌各2例，结直肠癌1例）。

2.5.2不良反应回输后最常见的不良反应为低热（24.14%，35/145），未出现高热反应；其次是皮疹（10.35％，15/145），5例（3.45％）出现一过性寒战，肌注异丙嗪后缓解，未见其他严重不良反应。

3讨论

恶性肿瘤已经成为导致人类死亡的主要原因之一，我国恶性肿瘤在各种死因中排第2位。多项研究表明，恶性肿瘤之所以能够在体内增殖、转移，主要原因是肿瘤缺少非主要组织相容性抗原(MHC)等能激活T细胞的分子，不能被T细胞识别，而无法激活T细胞介导的主动免疫。而今，恶性肿瘤的过继性免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要辅助手段。在临床上，淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞等细胞治疗已经成功用于某些肿瘤的冶疗，取得一定的疗效，但其缺点也很明显；体外增殖数量少、细胞杀瘤活性低、不良反应大等，限制了其进一步推广应用。

CIK细胞是以CD3+CD56+细胞为主的异质细胞群，是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T淋巴细胞，目前临床所用CIK细胞主要是以CD3+/CD8+和CD3+/CD56+为主的异质性细胞[6]。童春容等已经将CIK细胞用于临床白血病的治疗，并取得较好的疗效[7]。

DC细胞是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，它的独特之处在于它能激活幼稚T细胞，并且它抗原递呈能力比B细胞和巨噬细胞强100倍，在机体免疫系统中发挥着十分重要的作用。有研究表明，将负载抗原的DC细胞与CIK细胞共培养后，可促进DC与CIK细胞成熟[5],并可促进CIK的增殖和功能，其机制可能为：（1）成熟的DC表面的大量树枝状突起可使其负载肿瘤抗原并呈递给CIK细胞；（2）激活后的DC分泌IL12、IL18及IFNγ等细胞因子，刺激Th0、Th2 细胞向Th1细胞分化，并强烈激发Th1型特异性免疫应答；通过MHC Ⅱ类分子途径将外源性的肿瘤抗原呈递给CD8细胞，同时还提供充分的共刺激信号。笔者认为，DC有可能在特异性和非特异性免疫之间起到桥梁作用，而DCCIK治疗可作为肿瘤过继免疫治疗的首选方案。

本研究通过流式细胞仪检测发现，随着诱导培养时间的递增，CIK细胞CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比例增高，与培养前相比差别具有统计学意义（P<0.01），这说明诱导活化后的细胞既具有T细胞标志（CD3），也有NK细胞表面标志（CD56），因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。在细胞培养过程中，发现将DC细胞与ClK细胞共培养，可进一步促进ClK细胞的增殖，增殖倍数约为3～4倍，这为CIK有效地应用于临床提供了实验依据。笔者认为DC和CIK之间的相互作用，可引起DC和CIK细胞表面分子表达和细胞因子分泌的变化，共培养DC和CIK细胞可在体外扩增出大量的特异性的CD3+ CD56+细胞，并具有杀瘤活性强、杀瘤谱广泛、非MHC限制性的特点。

笔者将诱导活化12～15 d后的DCCIK细胞在临床上对患者进行回输，取得了较明显的疗效，表明CIK细胞过继免疫疗法能明显提高癌症患者免疫功能，改善临床症状，延长生存期，具有临床推广价值。

【参考文献】

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本文引用地址： http://www.referencepreparation.com/article/2010/0428/19328.html

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