神经节苷脂GM1对阿尔茨海默病的作用机制
2010-06-17 11:36:36 作者： 新特药房 来源： 互联网 浏览次数： 248 文字大小：【 大】【 中】【 小】 简介：
单位：北京医科大学第三医院神经内科 北京医科大学精神卫生研究所
摘 要 目的：研究神经节苷脂GM1对β淀粉样蛋白（Aβ）分泌和β淀粉样蛋白前体（APP）基因转录水平的影响，探讨GM1在阿尔茨海默 ...
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单位：北京医科大学第三医院神经内科 北京医科大学精神卫生研究所
摘 要 目的：研究神经节苷脂GM1对β淀粉样蛋白（Aβ）分泌和β淀粉样蛋白前体（APP）基因转录水平的影响，探讨GM1在阿尔茨海默病Aβ生成过程中的作用机制。方法：利用人类APP695基因转染神经母细胞瘤细胞株，免疫沉淀Western印迹法检测经不同浓度GM1处理的细胞培养液中的Aβ含量，逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法测定细胞中APP mRNA水平。结果：随GM1浓度增加，细胞分泌Aβ增加，GM110μmol．L-1组和100μmol．L-1组分别为对照组的1.33倍（t=1.29，P＞0.05）和3.07倍（t=3.63，P＜0.05）；而APP mRNA水平无变化，APP特异性片段与内参照的比值3个组无显著性差异（F=0.23，P＞0.05）。结论：GM1不影响APP基因转录水平，其促进细胞分泌Aβ的作用可能与干扰APP的水解代谢有关。
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）最主要的病理特征之一是老年斑（senile plaques，SP）形成。β-淀粉样蛋白（amyloid-β protein，βA4或Aβ）是SP的核心成份。AD病人脑中SP的数量与痴呆的严重程度呈正相关。因此，对于有关影响Aβ的生成、降解、聚集等因素的研究成为现今AD研究的热点之一。Aβ是它的前体蛋白——β-淀粉样蛋白前体（amyloid β-protein precursor，APP）的代谢产物，因而，影响APP表达及代谢的因素势必在Aβ生成过程中起重要作用。
神经节苷脂（gangliosides）GM1是中枢神经系统细胞膜的重要组成部分。对于GM1与AD的关系，目前研究存在争议。一方面，GM1具有促进神经生长的作用，对损伤后的神经组织有营养和修复等功能，临床上应用GM1治疗周围神经损伤、脊髓损伤和中风等，甚至有学者将其试用于AD的治疗。另一方面，研究发现，AD病人血中检出显著GM1抗体，AD病人脑组织中的质膜Aβ可与GM1紧密结合，膜结合型的GM1可以促进Aβ的纤维化，说明GM1有可能参与AD的发病机制。近期研究发现，外源性给予GM1可使人类APP695基因转染细胞分泌Aβ增加，细胞中APP含量增加。本研究即是在此基础上，利用APP695基因转染细胞模型，探讨GM1增加Aβ生成的作用是否与促进APP基因表达有关。
1 材料与方法
1．1 细胞模型与培养
人类APP695 cDNA转染人神经母细胞瘤细胞株（HY-SY5Y，德国海德堡大学分子生物学中心提供）。将细胞等分于3个50 ml培养瓶培养，每瓶加10 ml 培养基 （MEM及 F-12各半，加体积分数为10%的灭活胎牛血清，潮霉素B0．4mg．L-1，购于Gibco和BM公司），于37℃，5%（体积分数）CO2条件下培养，至细胞贴壁生长密度大于95%。弃培养液，用1×PBS（pH 7．5）洗涤，分别加入不含血清培养基3ml，两实验组分别加入10和100μmol．L-1GM1，对照组细胞加入等体积PBS（pH 7．5）。细胞于37℃，5%（体积分数）CO2条件下培养8h。
1．2 免疫沉淀及Western印迹检测培养基中的Aβ含量
分别取各组培养基，2500r．min-1离心20min，取上清。各加入抗Aβ1-16单克隆抗体W0-2（德国海德堡大学分子生物学中心提供）5μg，蛋白质G-agarose 25μl（BM公司），于室温旋转混合4h。离心（2500r．min-1，20min）后弃上清，沉淀物用10mmol．L-1 Tris缓冲液（pH 7．4）洗涤3次，加2×加样缓冲液各25μl，于95℃变性10min。离心，取上清上样。采用100g．L-1Tris-Tricine 凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜（350mA，40min）。NC膜置于PBS（pH7．5）中煮沸5min，室温下以100g．L－1脱脂奶粉（溶于PBS）封闭1 h，PBS漂洗3次，加入一抗W0-2（体积比1∶2000稀释于2．5g．L－1牛血清白蛋白的PBS中）室温下孵育1h。PBS漂洗后加碱性磷酸酶偶联抗鼠IgG（体积比1∶2000稀释于2.5g．L-1牛血清白蛋白的PBS中）室温孵育1 h，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系统染色。
1．3 RT-PCR
移去培养基的细胞用PBS洗涤，用RNA提取试剂（Life Technologies公司产品）及其提供的方法提取总RNA，并用该公司推荐方法进行逆转录，获得cDNA。
PCR APP695片段，上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′，下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′，扩增片段长度294bp。PCR反应条件，95℃3min后；94℃变性30s，60℃退火1min，70℃延伸1.5min；共35个循环，最后72℃10min。内参照采用3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），扩增片段长度572bp，扩增条件详见文献［9］。扩增完毕后两种PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。
1．4 结果统计
Western印迹结果经AGFA ARCUS Ⅱ扫描仪读取，PCR产物电泳结果经Kodak数字照相机拍照，采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software软件系统定量分析，吸光度数值用SPSS软件单因素方差分析及配对t检验进行统计学分析。
2 结果
细胞培养液中加入GM1后细胞分泌的Aβ含量增加，5次独立实验均得到相同结果（F=9.45， P＜0.01）。经配对t检验，10μmol．L-1 GM1组细胞分泌Aβ的含量为对照组的1.33倍（t=1.29， P＞0.05），而 100μmol．L－1组是对照组的3.07倍（t=3.63， P＜0.05），证明经较高浓度的GM1处理，细胞分泌的Aβ含量增加具有统计学意义（图1）。
RT-PCR结果：APP特异性片段与内参照的光密度比值3个组分别为1.38±0.32，1.35±0.18和1.45±0.16。配对t检验结果，10μmol．L-1组为对照组的0.97倍（t=0.52，P＞0.05），100μmol．L-1组是对照组的1.07倍（t= 0.61， P＞0.05）。3组之间无统计学差别（图2）。
3 讨论
Aβ由APP一种跨膜糖蛋白水解产生。在Aβ的N末端和C末端分别由β和γ分泌酶水解APP，产生完整的Aβ片段。在正常情况下，这并不是主要的代谢途径。由α分泌酶切割后产生的含部分Aβ片段的分泌性APP（APPs）和C末端片段是主要的途径。由于APP基因过表达导致APP生成增加，APP基因在α、β和γ分泌酶作用位点附近的突变，某些其他因素促进β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。
本研究结果证实，外源性GM1，可使细胞培养基中Aβ含量增多，这与既往文献结果类似。既往研究发现，GM1在促使Aβ释放的同时，使细胞溶解物中的APP含量增加，并减少APPs的生成，从而提出GM1干扰APP水解代谢的假说。但是，由于GM1本身能够参与细胞代谢，具有促进神经细胞生长的作用，因此，不能否认GM1可能通过某些环节促进APP基因的表达，使APP产量增加，进而增加Aβ的生成。或者GM1同时影响APP的合成代谢和水解代谢，两种作用结合，造成Aβ分泌的增多。本研究即是通过考察 APP基因的转录水平来探讨这一可能性是否存在。实验结果证明，给予不同浓度的GM1处理后，在Aβ的分泌明显增加的同时，细胞的APP mRNA水平并没有产生变化。说明GM1并不作用于APP基因的转录水平，APP的合成代谢不受影响。因此支持GM1干扰其分解代谢过程的假说。
此外，GM1处理一段时间后细胞培养液中的Aβ含量增多。除了细胞分泌Aβ增多外，尚有可能为培养液中GM1的存在抑制了Aβ的正常降解。研究发现Aβ可和GM1紧密结合，此种GM1结合型的Aβ是否不易被降解有待进一步研究。
本研究及既往文献的离体实验结果均提示GM1在AD的Aβ生成过程中起重要作用。推论在AD病人中，GM1本身的代谢可能发生异常。AD病人血液中GM1抗体的显著增加，也从另一方面支持这一推论。
本研究采用的GM1因其多方面的功能正是目前常用的一种临床制剂。因此，虽然GM1与AD的因果关系目前尚无定论，但其负面影响不容忽视。临床医生在使用GM1治疗神经系统疾病时需缜密考虑。总之，GM1在AD发病过程中所起的作用以及临床治疗的机制均需更深层次的研究。
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