1 材料与方法
1.1 细胞模型与培养
人类APP695 cDNA转染人神经母细胞瘤细胞株(HY-SY5Y,德国海德堡大学分子生物学中心提供)。将细胞等分于3个50 ml培养瓶培养,每瓶加10 ml 培养基 (MEM及 F-12各半,加体积分数为10%的灭活胎牛血清,潮霉素B0.4mg.L-1,购于Gibco和BM公司),于37℃,5%(体积分数)CO2条件下培养,至细胞贴壁生长密度大于95%。弃培养液,用1×PBS(pH 7.5)洗涤,分别加入不含血清培养基3ml,两实验组分别加入10和100μmol.L-1博司捷GM1,对照组细胞加入等体积PBS(pH 7.5)。细胞于37℃,5%(体积分数)CO2条件下培养8h。
1.2 免疫沉淀及Western印迹检测培养基中的Aβ含量
分别取各组培养基,2500r.min-1离心20min,取上清。各加入抗Aβ1-16单克隆抗体W0-2(德国海德堡大学分子生物学中心提供)5μg,蛋白质G-agarose 25μl(BM公司),于室温旋转混合4h。离心(2500r.min-1,20min)后弃上清,沉淀物用10mmol.L-1 Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤3次,加2×加样缓冲液各25μl,于95℃变性10min。离心,取上清上样。采用100g.L-1Tris-Tricine 凝胶电泳,电泳结束后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(350mA,40min)。NC膜置于PBS(pH7.5)中煮沸5min,室温下以100g.L-1脱脂奶粉(溶于PBS)封闭1 h,PBS漂洗3次,加入一抗W0-2(体积比1∶2000稀释于2.5g.L-1牛血清白蛋白的PBS中)室温下孵育1h。PBS漂洗后加碱性磷酸酶偶联抗鼠IgG(体积比1∶2000稀释于2.5g.L-1牛血清白蛋白的PBS中)室温孵育1 h,用PBS漂洗后以BCIP/NBT系统染色。
1.3 RT-PCR
移去培养基的细胞用PBS洗涤,用RNA提取试剂(Life Technologies公司产品)及其提供的方法提取总RNA,并用该公司推荐方法进行逆转录,获得cDNA。
PCR APP695片段,上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′,下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′,扩增片段长度294bp。PCR反应条件,95℃3min后;94℃变性30s,60℃退火1min,70℃延伸1.5min;共35个循环,最后72℃10min。内参照采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),扩增片段长度572bp,扩增条件详见文献。扩增完毕后两种PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。
1.4 结果统计
Western印迹结果经AGFA ARCUS Ⅱ扫描仪读取,PCR产物电泳结果经Kodak数字照相机拍照,采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software软件系统定量分析,吸光度数值用SPSS软件单因素方差分析及配对t检验进行统计学分析。
2 结果
细胞培养液中加入博司捷GM1后细胞分泌的Aβ含量增加,5次独立实验均得到相同结果(F=9.45, P<0.01)。经配对t检验,10μmol.L-1 博司捷GM1组细胞分泌Aβ的含量为对照组的1.33倍(t=1.29, P>0.05),而 100μmol.L-1组是对照组的3.07倍(t=3.63, P<0.05),证明经较高浓度的博司捷GM1处理,细胞分泌的Aβ含量增加具有统计学意义(图1)。
RT-PCR结果:APP特异性片段与内参照的光密度比值3个组分别为1.38±0.32,1.35±0.18和1.45±0.16。配对t检验结果,10μmol.L-1组为对照组的0.97倍(t=0.52,P>0.05),100μmol.L-1组是对照组的1.07倍(t= 0.61, P>0.05)。3组之间无统计学差别(图2)。
3 讨论
Aβ由APP一种跨膜糖蛋白水解产生。在Aβ的N末端和C末端分别由β和γ分泌酶水解APP,产生完整的Aβ片段。在正常情况下,这并不是主要的代谢途径。由α分泌酶切割后产生的含部分Aβ片段的分泌性APP(APPs)和C末端片段是主要的途径。由于APP基因过表达导致APP生成增加,APP基因在α、β和γ分泌酶作用位点附近的突变,某些其他因素促进β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。
本研究结果证实,外源性博司捷GM1,可使细胞培养基中Aβ含量增多,这与既往文献结果类似。既往研究发现,博司捷GM1在促使Aβ释放的同时,使细胞溶解物中的APP含量增加,并减少APPs的生成,从而提出博司捷GM1干扰APP水解代谢的假说。但是,由于博司捷GM1本身能够参与细胞代谢,具有促进神经细胞生长的作用,因此,不能否认博司捷GM1可能通过某些环节促进APP基因的表达,使APP产量增加,进而增加Aβ的生成。或者博司捷GM1同时影响APP的合成代谢和水解代谢,两种作用结合,造成Aβ分泌的增多。本研究即是通过考察 APP基因的转录水平来探讨这一可能性是否存在。实验结果证明,给予不同浓度的博司捷GM1处理后,在Aβ的分泌明显增加的同时,细胞的APP mRNA水平并没有产生变化。说明博司捷GM1并不作用于APP基因的转录水平,APP的合成代谢不受影响。因此支持博司捷GM1干扰其分解代谢过程的假说。
此外,博司捷GM1处理一段时间后细胞培养液中的Aβ含量增多。除了细胞分泌Aβ增多外,尚有可能为培养液中博司捷GM1的存在抑制了Aβ的正常降解。研究发现Aβ可和博司捷GM1紧密结合,此种博司捷GM1结合型的Aβ是否不易被降解有待进一步研究。
本研究及既往文献的离体实验结果均提示博司捷GM1在AD的Aβ生成过程中起重要作用。推论在AD病人中,博司捷GM1本身的代谢可能发生异常。AD病人血液中博司捷GM1抗体的显著增加,也从另一方面支持这一推论。
本研究采用的博司捷GM1因其多方面的功能正是目前常用的一种临床制剂。因此,虽然博司捷GM1与AD的因果关系目前尚无定论,但其负面影响不容忽视。临床医生在使用博司捷GM1治疗神经系统疾病时需缜密考虑。总之,博司捷GM1在AD发病过程中所起的作用以及临床治疗的机制均需更深层次的研究。