慢性乙型肝炎生物治疗若干研究进展
浙江大学医学院 陈 智
近年来，核苷类似物抗病毒制剂在抗HBV的治疗过程中正不断取得令人瞩目的进展。干扰素的临床应用经验更加丰富，通过剂型的改变，其疗效得到进一步提高。尽管如此，慢性乙型肝炎的治疗仍然存在许多困难。随着科学技术的快速发展，慢性乙型肝炎生物治疗的研究也取得许多成就，简要介绍如下：
一、反义核酸和核酶技术
反义技术主要包括反义寡核苷酸(ASON)和反义RNA(asRNA)和核酶（Ribozyme）。作为一种新的基因治疗技术, 是近几年来研究热点之一。
1．反义寡核苷酸
反义DNA/反义RNA分子以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义技术可以研究特定基因的功能，并可抑制、封闭某些有害或致病基因的表达以达到治疗疾病的目的 [1]。
Wu J 等[2]针对HBsAg设计表达反义RNA的载体，转染Hep3B细胞后发现，反义RNA可长期抑制Hep3B细胞表达HBsAg达10个月以上；Zu Putlitz 等也进行了类似的抗HBV的研究，抑制率达60％－75％[3]。
与反义DNA分子比较，反义RNA分子的获得，存在较大的困难。目前除化学合成外，别无其他来源，并且容易降解，因此距临床应用尚有一定距离。
2、核酶
核酶是一类独特的RNA分子，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表达。
乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链的DNA病毒。 其复制过程中有一个从前基因组RNA到DNA的逆转录过程。核酶能特异地切割HBV前基因组 RNA，使其丧失模板活性。Weizsacker et al构建了串联的核酶，针对HBV mRNA第2029-2031 nt，2044-2046 nt和2049-2051 nt位点设计的3组锤头状核酶，可有效的切割靶RNA，抑制或阻断HBV的复制，并可减少变异病毒逃逸的机会。Beck et al设计了针对HBV包装点的锤头状核酶，体外切割靶RNA，用U6 snRNA表达核酶与HBV共转染，也可有效切割靶RNA。 Welch et al使用三个发夹状核酶，在Huh7细胞中与HBV共表达，使其HBV表达下降66%，对核酶修饰后则抑制率达83%。 在真核细胞表达的成功，提示对HBV基因治疗有效。
目前核酶在体内应用研究虽已取得了很大的进展，但多处于实验阶段，其在临床上的应用，仍有很长的一段路要走。
二、RNA干扰
RNA干扰是指特异性针对目标基因的同源双链RNA的导入引起目标基因的不表达或者减效表达。是近年来出现的一个具有重大意义的发现。因其具有高效，特异，快速，毒副作用小等优点，很快被应用于抗病毒，生物体基因的表达、调控和功能分析等领域。在抗HIV-1,脊髓灰质炎病毒，流感病毒等人类致病病毒的实验研究中均取得较理想的结果，在转录后水平显著抑制病毒的复制和蛋白表达，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术。
此后，研究人员将RNA干扰技术应用与抗HBV的相关研究，也取得了很好的效果[4-9]。他们分别利用合成的siRNA或者载体表达的shRNA，针对HBV基因序列的不同部位进行干扰，在体内外实验中均取得非常好的抑制效果。Mccaffrey等利用与HBV mRNA同源的短发夹RNA质粒转染体外培养的HuH-7细胞而获得了RNAi效应。Northern杂交和免疫组化表明了细胞中HBV的 RNA水平明显下降，且分泌型HBsAg及HBcAg在细胞上清和细胞内都有不同程度的降低。同时，RNAi也可以在动物整体水平上抑制HBV的复制。Giladi等将HBV质粒和HBV特异性21bp的siRNA经尾静脉共注射入Balb/c小鼠，Southern印迹和免疫组化检测发现小鼠肝脏及血清的病毒DNA水平较对照组明显下降。此外，唐霓等将真核表达质粒pHBV1.3和RNAi质粒pSIHBV/C共转染HepG2细胞，免疫荧光检测发现细胞培养液中的HBsAg和HbeAg在24h后分别抑制了92%和85%，而细胞内的病毒抗原合成也降到了基础水平。 Anton P McCaffre[10]针对S基因区设计的shRNA具有显著的抑制效果，抑制率达到94.2%，在正常鼠或免疫缺陷鼠中肝细胞HBV RNA水平较对照组下降了77%和92%，小鼠血清中S蛋白和C蛋白的表达也显著下降，抑制率分别达到88%和99.7%。
但是由于RNA大量制备，干扰作用的维持，动物实验靶向选择等瓶颈问题的存在[11]，大大制约其发展。质粒载体的应用可以一定程度上缓解RNA制备的问题，但其安全性值得考虑。高水动力法注射是目前唯一应用在哺乳动物实验中的运输siRNA或载体的方法[9]，但由于注射的溶液量过大，可导致小鼠一过性休克，故该方法尚不能用于人体。因此尽管RNA技术有着广阔的前景，但是还存在着很多有待解决的问题，需要更广泛深入的研究。
三、治疗性乙型肝炎疫苗
近年来，基因重组技术及免疫学理论和技术的发展使得利用疫苗来治疗慢性HBV感染成为研究的热点[12]。目前认为，病毒清除是由于CTL介导的HBV感染的肝细胞溶解和/或CTL产生的细胞因子（如IFN-γ等）的抗病毒效应[13.14]，而多克隆、多特异性、应答强及IFN-γ分泌能力强的CTL尤为重要[15]。利用疫苗治疗慢性HBV感染的作用机制是通过对抗原的改造和/或抗原递呈途径的改变，使得T细胞更易识别抗原，促使前体T细胞增殖分化成效应T细胞来实现。
1、联合使用或优化现有疫苗
（1）血源疫苗或重组HBsAg疫苗
该类疫苗在预防HBV感染方面取得了肯定的效果。目前临床上有用血源乙肝疫苗联合猪苓多糖[16]、重组HBsAg疫苗联合干扰素[17]、HBsAg与拉米夫丁加或不加白细胞介素2[18]等治疗方案治疗慢性乙肝病人，显示一定的疗效，特别是对一些单用干扰素治疗无效者。
（2）含pre-S,和S抗原的疫苗
Malanchere-Bres等使用包含非甲基化CpG的寡聚核昔酸(CpG OND)的表面抗原(含preS2和S抗原)免疫转基因鼠后血循环中HBsAg消失同时伴有特异性抗体出现，肝内HBV mRNA的转录下调[19],而临床研究表明，该疫苗治疗慢性乙型肝炎患者可显著降低其HBV负荷[20],如果加用干扰素治疗6个月后部分病人HBVDNA转阴并伴有组织学改善[21]。研究表明使用疫苗免疫治疗后能不同程度打破免疫耐受，降低血清中病毒含量，为干扰素或其他治疗创造良机，提高疗效。
（3）免疫复合物性(IC)疫苗
闻玉梅教授等用重组HBsAg与鼠抗-HBs组建的免疫复合物免疫小鼠后发现，IC免疫鼠脾细胞较单独HBsAg免疫鼠脾细胞可诱生更多的Th1型细胞因子[22]，经证实这种免疫增强作用与通过抗体Fc段促进抗原提呈细胞摄取免疫复合物有关。应用重组的含免疫复合物基因的DNA疫苗与重组HBsAg、复合物疫苗、含S基因的质粒DNA分别免疫转基因鼠后，结果表明以含复合物基因的DNA疫苗组血清HBsAg下降最明显，抗HBs滴度、脾细胞INF-γ分泌均最高，同时CTL反应和肝细胞HBsAg表达下降最明显[23]。以上研究表明IC疫苗有一定的应用前景。
（4）多肽疫苗
CTL表位通常由10-20个左右氨基酸组成，其免疫原性较弱，常和佐剂(脂质分子)等联合后制成疫苗用于治疗。由于表位的识别需借助于MHC分子，后者具有高度的多态性，所以难于合成针对所有病人都有效的表位疫苗，也限制了表位疫苗的研究和应用。Chisari等[24]使用一种由两分子棕桐酸、破伤风毒素第830一843位氨基酸和核心抗原18 -27位氨基酸组成的疫苗，在小鼠试验中可诱生特异CTL，健康志愿者注射该疫苗500μg可诱生对HBcAg特异的CTL反应。此类疫苗的研究在于应用高效的Th表位和佐剂来提高疫苗的免疫原性。
2、核酸疫苗
核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，又称基因疫苗(genetic vaccine)、DNA疫苗，它是把编码免疫原或与免疫原相关的外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在动物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引起特异性的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。自Wollf等(1990)首次发现将携带外源基因的质粒DNA注入小鼠体内后会引发免疫现象以来，核酸疫苗免疫已成为国内外防治传染病的研究热点。由于基因疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，并对不同亚型的病原体具有交叉防御作用，同时具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性和生产方便等优点，被称为疫苗学研究的新纪元，是疫苗研究的第三次革命。美国FDA已批准乙肝、流感、结核、疟疾等数种核酸疫苗进人临床实验阶段。我国也有10余种核酸疫苗进人了临床前研究，乙肝DNA疫苗实验室工作也取得很大的进展。
核酸疫苗的构建是核酸疫苗研究的基础和重要环节。主要包括真核表达载体的选择、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定几个方面。
构建DNA疫苗的载体及其组件直接影响着外源抗原蛋白的表达量和机体的免疫反应状况。用于构建DNA疫苗的质粒载体有多种，但多以pUC或pBR322为基本骨架，这些载体均具有增强子一启动子(CMV、RSV或SV40启动子)、载体的选择标记(如Ampr、Kant)、翻译起始序列、转录终止序列和PolyA尾等元件。一般CMV(巨细胞病毒)启动子的调节功能最好，应用也最多。Short[25]等因发明了增强载体效率的方法而于2004年获得了美国专利，用该专利改进的载体促进抗原表达、细胞摄取，增加抗原在细胞内的稳定性等。
通常选择能够诱导机体产生保护性免疫基因用于构建DNA疫苗，可以是单个基因、完整的一组基因、编码抗原决定簇的一段或数段核苷酸序列等。它们可以来自同一病原体的不同基因，也可以来自不同病原体，由此可以将两个或多个抗原基因构建在同一表达载体上，形成多价或多联DNA疫苗，达到一种疫苗预防多个血清型／基因型或多个病原体的目的。因针对HBV S 抗原的抗体具有保护作用，所以多以HBV DNA S区， s区／前82(s1)区作为目的基因，也有选择c区或前c区基因做为目的基因。
接种方法和途径影响着DNA疫苗的免疫保护效果和反应类型。目前DNA疫苗的接种方法有注射接种法、基因枪接种法、非注射接种法(口服、吸入、涂擦等)和无针头(Biojector)接种法等。接种途径有肌肉、皮内、皮下、鼻腔、静脉、消化道、皮肤(涂擦)、腹腔等。其中肌肉注射接种法和基因枪接种法在研究中应用最多。
Davis等用分别表达乙型肝炎病毒表面抗原s蛋白(PCMV—S)，S+M蛋白，S+M+L蛋白DNA重组质粒免疫均诱生了特异性抗HBs应答所产生的抗HBs抗体。初期为IgM，其后为IgG(主要为IgG，)。与接受不同HBV蛋白质疫苗的黑猩猩相比，DNA疫苗的效果最好，诱导的免疫力持续时间最长。以c区或前c区基因做为目的基因有学者观察到PMUSCore结构(含编码I-IBcAg的DNA片段)。在Balb／c小鼠中诱发了强烈的剂量依赖性的抗一HBC效应和强烈的MHC I类分子限制性CD8+CTL反应。
尽管认为肌肉注射的效果较好，但最近He[26] 等采用单次口腔免疫包裹编码HbsAg DNA的微球不但诱导了持久的全身免疫，而且诱导了黏膜免疫，免疫后的小鼠血清中产生了特异性的γ干扰素，在肠道相关淋巴组织检测到IgA, 在脾脏产生了抗原特异性的CTL反应，相比之下，以相同剂量肌肉内注射的裸DNA疫苗仅诱导全身免疫，且较口腔黏膜免疫的的反应低，黏膜免疫较较肌肉注射具有较好的依从性。
Xu[27]等采用编码HBV核心抗原（HBcAg）CTL表位的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，结果成功诱导出HBV特异性的CTL反应，为了促进肽向内质网转运与MHC-1结合，内质网靶序列与HBV C 基因融合，结果融合后的序列显著提高了CD8(+)T 细胞反应及γ干扰素的分泌。2004年Sette[28]因发明了针对HBV抗原表位的核酸疫苗而获得美国专利。
核酸疫苗不仅有预防HBV感染的作用，而且具有治疗慢性HBV感染的潜力，Mancini-Bourgine M[29]等报道核酸疫苗在慢性HBV携带者能诱导特异性的T细胞反应，但维持的时间仍不够理想。
近年来人们正尝试使用共表达抗原、共刺激分子、细胞因子等手段改善DNA疫苗的免疫效果，尤其在细胞因子的应用方面进展迅速。有人将DNA疫苗与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)的表达载体DNA一起注射，提高了疫苗的免疫效率有几十倍 ，Chow等把s或前S2／S蛋白的编码基因克隆到白细胞介素2(1L-2)载体中进行融合表达。质粒DNA免疫小鼠后可增强HBV抗原的免疫应答水平，效力至少增强100倍，尤其是CTL还可特异识别HBV的抗原表位。对所表达的HBV抗原的靶细胞具有明显的CTL作用。国内外研究表明rhIL一1、rhll-2、rhIL石、rhIL—12、rhIFN、rhGM—CSF均能显著增加DNA疫苗诱导抗体产生。干扰素可提高HCV核酸疫苗的免疫，但是必须在一定的剂量范围内，否则，随着剂量增大，反而会显著抑制CTL反应[30]。
研究表明，与传统的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗等相比，以遗传方式直接进入机体的核酸疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白，且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL免疫)，对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。同时，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉保护作用；不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的回复突变问题；未发现裸体DNA对宿主细胞染色体的整合，比较安全；质粒载体本身不诱导免疫应答，可用同一或类似的载体作用后的免疫接种；核酸疫苗的制备只需对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需在体外表达和纯化，而且外源基因容易克隆进表达载体，数天内即可扩增并获得纯化产物。化学性质较稳定，耐高温，储存、运输过程中不需要传统疫苗所需的冷链系统，便于制备、储运；可把几种不同病原体的保护性基因序列克隆到一个载体上，制成多价基因疫苗，也可将抗原基因与某些细胞因子基因克隆到同一载体上起到联合免疫和增强免疫效果的作用；核酸疫苗不仅可用于预防，而且可用于治疗。
乙肝DNA疫苗不仅能引起宿主的体液免疫，还能产生细胞免疫，这是由于它模拟了病毒的自然感染过程。DNA质粒在注射部位被肌细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节合成的所编码的蛋白质。被细胞内蛋白酶复合体降解成含病毒表面抗原的肽段，进入内质网与合成的MHCI类分子结合，然后被转运系统递呈到细胞膜表面。此复合体共同激活CD8+CTL；部分被分泌或释放人血的蛋白质，激活特异性B细胞，从而产生保护性抗体。大约有10％的成人用重组s蛋白免疫后不能引起足够的免疫反应，其中至少1／4与HLA连锁。而DNA免疫可以克服小鼠H-2对HBV的无反应性，这一结果对免疫反应低和无反应人群有很好的临床意义。而根据小鼠和黑猩猩DNA疫苗实验结果，DNA疫苗的免疫效果优于HBsAg蛋白，尤其对无反应、低反应人群应用及阻止垂直传播的优势更加明显。DNA疫苗的免疫保护作用已得到公认，但要在临床上广泛应用，还有很长的路要走。DNA疫苗的安全性是大家特别关注的问题，①质粒DNA与宿主基因组的整合；②生物体对DNA疫苗的免疫耐受；③核酸疫苗诱导的免疫反应有可能诱发或加重自身免疫性疾病的发生等。但随着分子生物学和免疫学等相关科学的发展，相信在不久的将来，作为第三代乙肝疫苗的DNA乙肝疫苗在经过不断改善提高后将为人类根除乙肝起到巨大作用。
3、树突状细胞疫苗
树突状细胞（dendriticcell,DC）是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞，具有启动T细胞介导的免疫应答功能，因其表面具有众多树突状突起而得名。DC是由美国学者Steinman及Cohn于1973年发现的。自从1992年Steinman建立了应用冲阻力细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ,GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法后，人们又建立并完善了多种多种培养扩增DC的方法，这使得对DC的研究得以深入。它在感染免疫应答中具有重要作用，并在肿瘤免疫治疗、器官移植和慢性乙型肝炎的治疗中引人注目。
成熟DC从细胞胞体的各个方面伸出约10um的突起，并具有活跃的运动能力，无或仅有微弱的吞噬功能，对玻璃或塑料缺乏持久的粘附能力。DC能表达丰富且与抗原递呈有关的MHCI类和II类分子，如HLA-DP、DQ、DR、HLA-A、B、C等，并高水平地表达多种共刺激分子，如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、LFA-3(CD58)、ICAM-1(CD54)、ICAM-3(CD50)及CD40。这些分子介导DC与T细胞的结合并具有共刺激的功能。DC还表达CD123、CD83、CD1a、CD11C,不表达CD14分子，Fc受体低表达或缺乏。DC缺乏髓过氧化物酶和溶菌酶，而非特异酯酶阴性或仅弱阳性。上述特征表明，DC在分化过程中丧失了许多吞噬细胞所具有的功能，而获得了高水平MHC分子和共刺激分子的表达，使DC能有效地将抗原递呈给T细胞，因而DC是一种独立的细胞类型。
DC作为专职的抗原递呈细胞，能摄取、加工、及递呈抗原，并在缺乏其他任何刺激因子的条件下启动机体的免疫应答，因而获得天然佐剂的美名。DC与吞噬细胞在功能上的本质差别在于吞噬细胞能清除抗原，而DC则递呈抗原。
未成熟DC在接触抗原后首先捕获抗原，继而将抗原输送到细胞内酸性液胞区，并在该处将抗原加工为短肽，然后转运到细胞内MHCI、II类分子富集区，与新合成的MHCI、II类分子共同形成-MHC分子复合物，并表达于DC细胞表面。继而DC入血，迁徙到外周淋巴器官的T细胞聚集区，将其表面丰富表达的MHC分子上的肽类抗原递呈给T细胞，经T细胞识别后即启动MHCI类限制性细胞毒性T细胞应答和MHCII类限制性T辅助细胞的应答。此外，DC还高水平的的表达一系列共刺激分子，如CD80、CD86、CD40等，它们介导DC与T细胞结合。
近年来，研究者通过多种方式直接或间接恢复和增强DC的抗原提呈功能，包括：⑴ 细胞因子（IL-12、IFN-γ、IFN-α等）体内外的作用；⑵ HBsAg疫苗体内刺激；⑶优化的增强DC摄取功能的DNA疫苗；⑷DC体外诱导和抗原冲击或基因修饰后回输（DC疫苗）。
DC用于病毒的免疫治疗主要是通过体外病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒抗原特异性CTL，杀伤病毒感染的细胞。用抗原致敏DC的方法有多种：可通过病毒抗原肽或蛋白直接冲击DC；用灭活的病毒疫苗共同温育；还可用阳离子脂质体携带病毒gag、poc及env全部蛋白质或合成的双链RNA冲击，但最常用的方法仍然是用病毒抗原多肽致敏DC。
Onji领导的研究小组用含有佐剂的HBsAg疫苗治疗Tg鼠，每月注射一次，连续12个月，对照组只用佐剂。结果发现，5~6个月后血清HBsAg和HBeAg滴度开始下降，12个月后，60%~80%实验鼠转阴，HBV DNA也减少，表明该疫苗有效打破HBV耐受。但是，所有Tg鼠治疗前血清HBsAg、HBeAg和DNA滴度均相同，而部分却没有对疫苗发生反应。 进一步研究证实，Tg鼠DC非常异质，其中DC功能相对较好者对疫苗治疗有反应，而较差者则无反应。因此，诱导DC活化是疫苗治疗作用的关键，治疗前Tg鼠DC的功能对疫苗治疗结果有预后作用。
最近，该研究小组通过两次腹膜内注射与HBsAg共培养24h的脾脏DC疫苗，结果所有Tg鼠血清HBsAg均转阴，并出现抗-HBs，而其他实验组（单纯DC疫苗；HBsAg疫苗；佐剂对照等）都未出现该结果。
有研究发现乙肝疫苗接种能活化DC，DC的活化程度较HBV血清学标记物（如HBsAg、HBeAg，等）更有助于预测HBV携带者接受疫苗治疗的效果。以HBV转基因小鼠为研究对象，对性别、年龄、MHC背景完全相同的60只转基因小鼠随机分为三组：疫苗治疗组腹腔注射完全弗氏佐剂（CMF）乳化的乙型肝炎疫苗，安慰组注射CMF，对照组不予处理。各组在注射前血清HBsAg、HBeAg滴度均相同。在疫苗注射结束后（每月注射1次，连续注射12个月），治疗组35只转基因小鼠中有22只HBsAg、HBeAg完全转阴，抗HBs显著提高，安慰剂组与对照组HBV血清学标记物滴度则无显著变化。由于疫苗治疗的效果还依赖于宿主的应答性，通过观察淋巴细胞对多克隆有丝分裂原的增殖反应以及免疫球蛋白得产生，证实了其应答性在对照组、疫苗治疗组中的有反应者和无反应者蛋白质几乎完全相同，从而排除了宿主淋巴细胞对免疫治疗有直接的影响。进一步的研究发现，疫苗治疗的应答同接受前DC的功能有关。在DC功能良好的23只转基因小鼠中，其HBsAg、HBcAg在疫苗治疗后完全转阴，且HBVDNA水平下降；而DC功能不良的19只则完全没有应答。此外，DC功能良好的小鼠，其DC有MHCII、CD86表达的上调及IL-12产生的增加，该研究提示，可通过DC的活化来预测疫苗治疗的效果。
还有人通过小鼠皮下或肌肉注射携带编码病毒抗原基因的裸质粒DNA，也能激发抗病毒的T细胞免疫，其机制可能是使宿主细胞合成外源基因编码的蛋白质，然后被DC摄入、处理和递呈，或者DC摄入质粒，然后合成和处理并递呈外源基因产物。
Shimizu等以HBsAg质粒DNA或BMDC免疫五个品系的HBV Tg鼠，试图在B细胞和T细胞水平打破耐受。结果DNA免疫只诱导了抗-HBs，没有产生特异性CTL；而DC免疫诱导了HBs28-39特异的CTL应答。但是，两种免疫方法均未引起肝细胞炎症及HBV DNA复制抑制，因此认为还需更有效的免疫策略刺激足够强的免疫应答以获得抗病毒的免疫效果。Stober等用HBsAg颗粒体外冲击BMDC及源于脾脏和肝脏的DC，也发现HBsAg能有效进入DC的任何加工途径，并能提呈表位给MHCⅠ类分子限制的特异性CTL。类似方法在临床上也体现了效果。Li等把19位慢性乙肝病人的PBDC体外用HBsAg冲击后皮下注射自体回输，结果有10人血清HBeAg清除，5人有HBeAg/抗-HBe血清转换，HBV DNA拷贝数下降，2名联合用拉米夫丁的病人有完全临床反应，而且ALT水平异常或正常的病人对DC治疗的反应相同。
DNA疫苗虽然可诱导体液免疫和细胞免疫，但由于体内只有十分有限的DNA分子被DC摄取，影响了其免疫效果。You等设计了能表达HBeAg和IgG Fc融合蛋白的DNA疫苗，通过体内表达的IgG Fc和DC表面FcγR结合，促进DC捕获和处理HBeAg的能力，能普遍增强CD4+Th、CD8+CTL和B 细胞应答。
由于MHC-肽复合物半衰期较短，其寿命决定了CTL反应的效率，因此要保持高水平而持久的抗病毒免疫应答需用致敏的DC重复刺激机体。为使DC能持续地递呈病毒抗原多肽，可将病毒抗原多肽基因导入DC，使DC表面能持续表达基因产物，从而有效地诱导出特异性T细胞应答。为达此目的，必须有适合的基因载体。有人将编码荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因的质粒DNA通过聚乙烯亚胺（PEI）结合于腺病毒微粒（Ad）上，转染入DC，发现Ad-PEI-DNA转染复合体产生较高的转导水平，并且能持续表达荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因产物。这种DC也能刺激同种和自体混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖，并且可以抗原特异方式激活T细胞，因为DC表面也有甘露糖受体的高表达。
还有人用甘露糖组成Mam-PEI-DNA复合体，通过甘露糖受体介导和内吞作用转染DC,发现这种复合体传递基因不如Ad-PEI转染有效，而Mam-PEI-DNA转染复合体结合腺病毒则能更进一步增强转导效率和转基因表达，提高病毒基因传递系统的转导效率较非病毒系统更高。其他的载体还有逆转录病毒、疫苗病毒、阴离子蛋白体，或以电穿孔法导入基因。目前认为，腺病毒较其它病毒爱踢能产生更高的转染效率。
另外，Ding等以逆转录病毒为载体给小鼠BMDC转导HBc基因，发现该基因修饰的DC皮下免疫C57BL/6小鼠，能诱导比HBcAg免疫更强的Th1和特异性CTL应答。Hu等用重组腺相关病毒（rAAV）介导HBsAg基因感染人PBDC，同样证实该DC比处女DC在刺激Th1分化上更有效，但DC的表型、IL-12产生等功能不受影响，提示这种DC疫苗可应用于HBV感染的免疫治疗。
有人将编码肿瘤抗原的基因转入DC和成纤维细胞，并与标准的遗传免疫进行比较，一次注射500~1000个转基因DC就可以达到标准遗传免疫的效果，而这需要注射至少50倍的转基因成纤维细胞。因此，少量的DC便可激活大范围的免疫应答。
我们研究所最近的研究结果表明，Ad-S转导的DC能诱导比HBsAg蛋白冲击DC及DNA疫苗更强的I型免疫应答和特异性CTL免疫，对HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏组织HBcAg和HBsAg的表达有较迅速和明显的抑制作用。
目前的研究报道，从慢性乙型肝炎患者的外周血中分离DC，体外扩增同时用匙孔血蓝蛋白和HBsAg等进行刺激，7~9d后回输，试治疗慢性乙型肝炎，结果表明此疗法可促使HBeAg、HBVDNA阴转，肝功能趋于稳定。
近年来，核苷类似物抗病毒制剂在抗HBV的治疗过程中正不断取得令人瞩目的进展。干扰素的临床应用经验更加丰富，通过剂型的改变，其疗效得到进一步提高。尽管如此，慢性乙型肝炎的治疗仍然存在许多困难。随着科学技术的快速发展，慢性乙型肝炎生物治疗的研究也取得许多成就，简要介绍如下：
一、反义核酸和核酶技术
反义技术主要包括反义寡核苷酸(ASON)和反义RNA(asRNA)和核酶（Ribozyme）。作为一种新的基因治疗技术, 是近几年来研究热点之一。
1．反义寡核苷酸
反义DNA/反义RNA分子以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义技术可以研究特定基因的功能，并可抑制、封闭某些有害或致病基因的表达以达到治疗疾病的目的 [1]。
Wu J 等[2]针对HBsAg设计表达反义RNA的载体，转染Hep3B细胞后发现，反义RNA可长期抑制Hep3B细胞表达HBsAg达10个月以上；Zu Putlitz 等也进行了类似的抗HBV的研究，抑制率达60％－75％[3]。
与反义DNA分子比较，反义RNA分子的获得，存在较大的困难。目前除化学合成外，别无其他来源，并且容易降解，因此距临床应用尚有一定距离。
2、核酶
核酶是一类独特的RNA分子，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表达。
乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链的DNA病毒。 其复制过程中有一个从前基因组RNA到DNA的逆转录过程。核酶能特异地切割HBV前基因组 RNA，使其丧失模板活性。Weizsacker et al构建了串联的核酶，针对HBV mRNA第2029-2031 nt，2044-2046 nt和2049-2051 nt位点设计的3组锤头状核酶，可有效的切割靶RNA，抑制或阻断HBV的复制，并可减少变异病毒逃逸的机会。Beck et al设计了针对HBV包装点的锤头状核酶，体外切割靶RNA，用U6 snRNA表达核酶与HBV共转染，也可有效切割靶RNA。 Welch et al使用三个发夹状核酶，在Huh7细胞中与HBV共表达，使其HBV表达下降66%，对核酶修饰后则抑制率达83%。 在真核细胞表达的成功，提示对HBV基因治疗有效。
目前核酶在体内应用研究虽已取得了很大的进展，但多处于实验阶段，其在临床上的应用，仍有很长的一段路要走。
二、RNA干扰
RNA干扰是指特异性针对目标基因的同源双链RNA的导入引起目标基因的不表达或者减效表达。是近年来出现的一个具有重大意义的发现。因其具有高效，特异，快速，毒副作用小等优点，很快被应用于抗病毒，生物体基因的表达、调控和功能分析等领域。在抗HIV-1,脊髓灰质炎病毒，流感病毒等人类致病病毒的实验研究中均取得较理想的结果，在转录后水平显著抑制病毒的复制和蛋白表达，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术。
此后，研究人员将RNA干扰技术应用与抗HBV的相关研究，也取得了很好的效果[4-9]。他们分别利用合成的siRNA或者载体表达的shRNA，针对HBV基因序列的不同部位进行干扰，在体内外实验中均取得非常好的抑制效果。Mccaffrey等利用与HBV mRNA同源的短发夹RNA质粒转染体外培养的HuH-7细胞而获得了RNAi效应。Northern杂交和免疫组化表明了细胞中HBV的 RNA水平明显下降，且分泌型HBsAg及HBcAg在细胞上清和细胞内都有不同程度的降低。同时，RNAi也可以在动物整体水平上抑制HBV的复制。Giladi等将HBV质粒和HBV特异性21bp的siRNA经尾静脉共注射入Balb/c小鼠，Southern印迹和免疫组化检测发现小鼠肝脏及血清的病毒DNA水平较对照组明显下降。此外，唐霓等将真核表达质粒pHBV1.3和RNAi质粒pSIHBV/C共转染HepG2细胞，免疫荧光检测发现细胞培养液中的HBsAg和HbeAg在24h后分别抑制了92%和85%，而细胞内的病毒抗原合成也降到了基础水平。 Anton P McCaffre[10]针对S基因区设计的shRNA具有显著的抑制效果，抑制率达到94.2%，在正常鼠或免疫缺陷鼠中肝细胞HBV RNA水平较对照组下降了77%和92%，小鼠血清中S蛋白和C蛋白的表达也显著下降，抑制率分别达到88%和99.7%。
但是由于RNA大量制备，干扰作用的维持，动物实验靶向选择等瓶颈问题的存在[11]，大大制约其发展。质粒载体的应用可以一定程度上缓解RNA制备的问题，但其安全性值得考虑。高水动力法注射是目前唯一应用在哺乳动物实验中的运输siRNA或载体的方法[9]，但由于注射的溶液量过大，可导致小鼠一过性休克，故该方法尚不能用于人体。因此尽管RNA技术有着广阔的前景，但是还存在着很多有待解决的问题，需要更广泛深入的研究。
三、治疗性乙型肝炎疫苗
近年来，基因重组技术及免疫学理论和技术的发展使得利用疫苗来治疗慢性HBV感染成为研究的热点[12]。目前认为，病毒清除是由于CTL介导的HBV感染的肝细胞溶解和/或CTL产生的细胞因子（如IFN-γ等）的抗病毒效应[13.14]，而多克隆、多特异性、应答强及IFN-γ分泌能力强的CTL尤为重要[15]。利用疫苗治疗慢性HBV感染的作用机制是通过对抗原的改造和/或抗原递呈途径的改变，使得T细胞更易识别抗原，促使前体T细胞增殖分化成效应T细胞来实现。
1、联合使用或优化现有疫苗
（1）血源疫苗或重组HBsAg疫苗
该类疫苗在预防HBV感染方面取得了肯定的效果。目前临床上有用血源乙肝疫苗联合猪苓多糖[16]、重组HBsAg疫苗联合干扰素[17]、HBsAg与拉米夫丁加或不加白细胞介素2[18]等治疗方案治疗慢性乙肝病人，显示一定的疗效，特别是对一些单用干扰素治疗无效者。
（2）含pre-S,和S抗原的疫苗
Malanchere-Bres等使用包含非甲基化CpG的寡聚核昔酸(CpG OND)的表面抗原(含preS2和S抗原)免疫转基因鼠后血循环中HBsAg消失同时伴有特异性抗体出现，肝内HBV mRNA的转录下调[19],而临床研究表明，该疫苗治疗慢性乙型肝炎患者可显著降低其HBV负荷[20],如果加用干扰素治疗6个月后部分病人HBVDNA转阴并伴有组织学改善[21]。研究表明使用疫苗免疫治疗后能不同程度打破免疫耐受，降低血清中病毒含量，为干扰素或其他治疗创造良机，提高疗效。
（3）免疫复合物性(IC)疫苗
闻玉梅教授等用重组HBsAg与鼠抗-HBs组建的免疫复合物免疫小鼠后发现，IC免疫鼠脾细胞较单独HBsAg免疫鼠脾细胞可诱生更多的Th1型细胞因子[22]，经证实这种免疫增强作用与通过抗体Fc段促进抗原提呈细胞摄取免疫复合物有关。应用重组的含免疫复合物基因的DNA疫苗与重组HBsAg、复合物疫苗、含S基因的质粒DNA分别免疫转基因鼠后，结果表明以含复合物基因的DNA疫苗组血清HBsAg下降最明显，抗HBs滴度、脾细胞INF-γ分泌均最高，同时CTL反应和肝细胞HBsAg表达下降最明显[23]。以上研究表明IC疫苗有一定的应用前景。
（4）多肽疫苗
CTL表位通常由10-20个左右氨基酸组成，其免疫原性较弱，常和佐剂(脂质分子)等联合后制成疫苗用于治疗。由于表位的识别需借助于MHC分子，后者具有高度的多态性，所以难于合成针对所有病人都有效的表位疫苗，也限制了表位疫苗的研究和应用。Chisari等[24]使用一种由两分子棕桐酸、破伤风毒素第830一843位氨基酸和核心抗原18 -27位氨基酸组成的疫苗，在小鼠试验中可诱生特异CTL，健康志愿者注射该疫苗500μg可诱生对HBcAg特异的CTL反应。此类疫苗的研究在于应用高效的Th表位和佐剂来提高疫苗的免疫原性。
2、核酸疫苗
核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，又称基因疫苗(genetic vaccine)、DNA疫苗，它是把编码免疫原或与免疫原相关的外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在动物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引起特异性的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。自Wollf等(1990)首次发现将携带外源基因的质粒DNA注入小鼠体内后会引发免疫现象以来，核酸疫苗免疫已成为国内外防治传染病的研究热点。由于基因疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，并对不同亚型的病原体具有交叉防御作用，同时具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性和生产方便等优点，被称为疫苗学研究的新纪元，是疫苗研究的第三次革命。美国FDA已批准乙肝、流感、结核、疟疾等数种核酸疫苗进人临床实验阶段。我国也有10余种核酸疫苗进人了临床前研究，乙肝DNA疫苗实验室工作也取得很大的进展。
核酸疫苗的构建是核酸疫苗研究的基础和重要环节。主要包括真核表达载体的选择、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定几个方面。
构建DNA疫苗的载体及其组件直接影响着外源抗原蛋白的表达量和机体的免疫反应状况。用于构建DNA疫苗的质粒载体有多种，但多以pUC或pBR322为基本骨架，这些载体均具有增强子一启动子(CMV、RSV或SV40启动子)、载体的选择标记(如Ampr、Kant)、翻译起始序列、转录终止序列和PolyA尾等元件。一般CMV(巨细胞病毒)启动子的调节功能最好，应用也最多。Short[25]等因发明了增强载体效率的方法而于2004年获得了美国专利，用该专利改进的载体促进抗原表达、细胞摄取，增加抗原在细胞内的稳定性等。
通常选择能够诱导机体产生保护性免疫基因用于构建DNA疫苗，可以是单个基因、完整的一组基因、编码抗原决定簇的一段或数段核苷酸序列等。它们可以来自同一病原体的不同基因，也可以来自不同病原体，由此可以将两个或多个抗原基因构建在同一表达载体上，形成多价或多联DNA疫苗，达到一种疫苗预防多个血清型／基因型或多个病原体的目的。因针对HBV S 抗原的抗体具有保护作用，所以多以HBV DNA S区， s区／前82(s1)区作为目的基因，也有选择c区或前c区基因做为目的基因。
接种方法和途径影响着DNA疫苗的免疫保护效果和反应类型。目前DNA疫苗的接种方法有注射接种法、基因枪接种法、非注射接种法(口服、吸入、涂擦等)和无针头(Biojector)接种法等。接种途径有肌肉、皮内、皮下、鼻腔、静脉、消化道、皮肤(涂擦)、腹腔等。其中肌肉注射接种法和基因枪接种法在研究中应用最多。
Davis等用分别表达乙型肝炎病毒表面抗原s蛋白(PCMV—S)，S+M蛋白，S+M+L蛋白DNA重组质粒免疫均诱生了特异性抗HBs应答所产生的抗HBs抗体。初期为IgM，其后为IgG(主要为IgG，)。与接受不同HBV蛋白质疫苗的黑猩猩相比，DNA疫苗的效果最好，诱导的免疫力持续时间最长。以c区或前c区基因做为目的基因有学者观察到PMUSCore结构(含编码I-IBcAg的DNA片段)。在Balb／c小鼠中诱发了强烈的剂量依赖性的抗一HBC效应和强烈的MHC I类分子限制性CD8+CTL反应。
尽管认为肌肉注射的效果较好，但最近He[26] 等采用单次口腔免疫包裹编码HbsAg DNA的微球不但诱导了持久的全身免疫，而且诱导了黏膜免疫，免疫后的小鼠血清中产生了特异性的γ干扰素，在肠道相关淋巴组织检测到IgA, 在脾脏产生了抗原特异性的CTL反应，相比之下，以相同剂量肌肉内注射的裸DNA疫苗仅诱导全身免疫，且较口腔黏膜免疫的的反应低，黏膜免疫较较肌肉注射具有较好的依从性。
Xu[27]等采用编码HBV核心抗原（HBcAg）CTL表位的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，结果成功诱导出HBV特异性的CTL反应，为了促进肽向内质网转运与MHC-1结合，内质网靶序列与HBV C 基因融合，结果融合后的序列显著提高了CD8(+)T 细胞反应及γ干扰素的分泌。2004年Sette[28]因发明了针对HBV抗原表位的核酸疫苗而获得美国专利。
核酸疫苗不仅有预防HBV感染的作用，而且具有治疗慢性HBV感染的潜力，Mancini-Bourgine M[29]等报道核酸疫苗在慢性HBV携带者能诱导特异性的T细胞反应，但维持的时间仍不够理想。
近年来人们正尝试使用共表达抗原、共刺激分子、细胞因子等手段改善DNA疫苗的免疫效果，尤其在细胞因子的应用方面进展迅速。有人将DNA疫苗与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)的表达载体DNA一起注射，提高了疫苗的免疫效率有几十倍 ，Chow等把s或前S2／S蛋白的编码基因克隆到白细胞介素2(1L-2)载体中进行融合表达。质粒DNA免疫小鼠后可增强HBV抗原的免疫应答水平，效力至少增强100倍，尤其是CTL还可特异识别HBV的抗原表位。对所表达的HBV抗原的靶细胞具有明显的CTL作用。国内外研究表明rhIL一1、rhll-2、rhIL石、rhIL—12、rhIFN、rhGM—CSF均能显著增加DNA疫苗诱导抗体产生。干扰素可提高HCV核酸疫苗的免疫，但是必须在一定的剂量范围内，否则，随着剂量增大，反而会显著抑制CTL反应[30]。
研究表明，与传统的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗等相比，以遗传方式直接进入机体的核酸疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白，且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL免疫)，对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。同时，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉保护作用；不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的回复突变问题；未发现裸体DNA对宿主细胞染色体的整合，比较安全；质粒载体本身不诱导免疫应答，可用同一或类似的载体作用后的免疫接种；核酸疫苗的制备只需对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需在体外表达和纯化，而且外源基因容易克隆进表达载体，数天内即可扩增并获得纯化产物。化学性质较稳定，耐高温，储存、运输过程中不需要传统疫苗所需的冷链系统，便于制备、储运；可把几种不同病原体的保护性基因序列克隆到一个载体上，制成多价基因疫苗，也可将抗原基因与某些细胞因子基因克隆到同一载体上起到联合免疫和增强免疫效果的作用；核酸疫苗不仅可用于预防，而且可用于治疗。
乙肝DNA疫苗不仅能引起宿主的体液免疫，还能产生细胞免疫，这是由于它模拟了病毒的自然感染过程。DNA质粒在注射部位被肌细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节合成的所编码的蛋白质。被细胞内蛋白酶复合体降解成含病毒表面抗原的肽段，进入内质网与合成的MHCI类分子结合，然后被转运系统递呈到细胞膜表面。此复合体共同激活CD8+CTL；部分被分泌或释放人血的蛋白质，激活特异性B细胞，从而产生保护性抗体。大约有10％的成人用重组s蛋白免疫后不能引起足够的免疫反应，其中至少1／4与HLA连锁。而DNA免疫可以克服小鼠H-2对HBV的无反应性，这一结果对免疫反应低和无反应人群有很好的临床意义。而根据小鼠和黑猩猩DNA疫苗实验结果，DNA疫苗的免疫效果优于HBsAg蛋白，尤其对无反应、低反应人群应用及阻止垂直传播的优势更加明显。DNA疫苗的免疫保护作用已得到公认，但要在临床上广泛应用，还有很长的路要走。DNA疫苗的安全性是大家特别关注的问题，①质粒DNA与宿主基因组的整合；②生物体对DNA疫苗的免疫耐受；③核酸疫苗诱导的免疫反应有可能诱发或加重自身免疫性疾病的发生等。但随着分子生物学和免疫学等相关科学的发展，相信在不久的将来，作为第三代乙肝疫苗的DNA乙肝疫苗在经过不断改善提高后将为人类根除乙肝起到巨大作用。
3、树突状细胞疫苗
树突状细胞（dendriticcell,DC）是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞，具有启动T细胞介导的免疫应答功能，因其表面具有众多树突状突起而得名。DC是由美国学者Steinman及Cohn于1973年发现的。自从1992年Steinman建立了应用冲阻力细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ,GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法后，人们又建立并完善了多种多种培养扩增DC的方法，这使得对DC的研究得以深入。它在感染免疫应答中具有重要作用，并在肿瘤免疫治疗、器官移植和慢性乙型肝炎的治疗中引人注目。
成熟DC从细胞胞体的各个方面伸出约10um的突起，并具有活跃的运动能力，无或仅有微弱的吞噬功能，对玻璃或塑料缺乏持久的粘附能力。DC能表达丰富且与抗原递呈有关的MHCI类和II类分子，如HLA-DP、DQ、DR、HLA-A、B、C等，并高水平地表达多种共刺激分子，如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、LFA-3(CD58)、ICAM-1(CD54)、ICAM-3(CD50)及CD40。这些分子介导DC与T细胞的结合并具有共刺激的功能。DC还表达CD123、CD83、CD1a、CD11C,不表达CD14分子，Fc受体低表达或缺乏。DC缺乏髓过氧化物酶和溶菌酶，而非特异酯酶阴性或仅弱阳性。上述特征表明，DC在分化过程中丧失了许多吞噬细胞所具有的功能，而获得了高水平MHC分子和共刺激分子的表达，使DC能有效地将抗原递呈给T细胞，因而DC是一种独立的细胞类型。
DC作为专职的抗原递呈细胞，能摄取、加工、及递呈抗原，并在缺乏其他任何刺激因子的条件下启动机体的免疫应答，因而获得天然佐剂的美名。DC与吞噬细胞在功能上的本质差别在于吞噬细胞能清除抗原，而DC则递呈抗原。
未成熟DC在接触抗原后首先捕获抗原，继而将抗原输送到细胞内酸性液胞区，并在该处将抗原加工为短肽，然后转运到细胞内MHCI、II类分子富集区，与新合成的MHCI、II类分子共同形成-MHC分子复合物，并表达于DC细胞表面。继而DC入血，迁徙到外周淋巴器官的T细胞聚集区，将其表面丰富表达的MHC分子上的肽类抗原递呈给T细胞，经T细胞识别后即启动MHCI类限制性细胞毒性T细胞应答和MHCII类限制性T辅助细胞的应答。此外，DC还高水平的的表达一系列共刺激分子，如CD80、CD86、CD40等，它们介导DC与T细胞结合。
近年来，研究者通过多种方式直接或间接恢复和增强DC的抗原提呈功能，包括：⑴ 细胞因子（IL-12、IFN-γ、IFN-α等）体内外的作用；⑵ HBsAg疫苗体内刺激；⑶优化的增强DC摄取功能的DNA疫苗；⑷DC体外诱导和抗原冲击或基因修饰后回输（DC疫苗）。
DC用于病毒的免疫治疗主要是通过体外病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒抗原特异性CTL，杀伤病毒感染的细胞。用抗原致敏DC的方法有多种：可通过病毒抗原肽或蛋白直接冲击DC；用灭活的病毒疫苗共同温育；还可用阳离子脂质体携带病毒gag、poc及env全部蛋白质或合成的双链RNA冲击，但最常用的方法仍然是用病毒抗原多肽致敏DC。
Onji领导的研究小组用含有佐剂的HBsAg疫苗治疗Tg鼠，每月注射一次，连续12个月，对照组只用佐剂。结果发现，5~6个月后血清HBsAg和HBeAg滴度开始下降，12个月后，60%~80%实验鼠转阴，HBV DNA也减少，表明该疫苗有效打破HBV耐受。但是，所有Tg鼠治疗前血清HBsAg、HBeAg和DNA滴度均相同，而部分却没有对疫苗发生反应。 进一步研究证实，Tg鼠DC非常异质，其中DC功能相对较好者对疫苗治疗有反应，而较差者则无反应。因此，诱导DC活化是疫苗治疗作用的关键，治疗前Tg鼠DC的功能对疫苗治疗结果有预后作用。
最近，该研究小组通过两次腹膜内注射与HBsAg共培养24h的脾脏DC疫苗，结果所有Tg鼠血清HBsAg均转阴，并出现抗-HBs，而其他实验组（单纯DC疫苗；HBsAg疫苗；佐剂对照等）都未出现该结果。
有研究发现乙肝疫苗接种能活化DC，DC的活化程度较HBV血清学标记物（如HBsAg、HBeAg，等）更有助于预测HBV携带者接受疫苗治疗的效果。以HBV转基因小鼠为研究对象，对性别、年龄、MHC背景完全相同的60只转基因小鼠随机分为三组：疫苗治疗组腹腔注射完全弗氏佐剂（CMF）乳化的乙型肝炎疫苗，安慰组注射CMF，对照组不予处理。各组在注射前血清HBsAg、HBeAg滴度均相同。在疫苗注射结束后（每月注射1次，连续注射12个月），治疗组35只转基因小鼠中有22只HBsAg、HBeAg完全转阴，抗HBs显著提高，安慰剂组与对照组HBV血清学标记物滴度则无显著变化。由于疫苗治疗的效果还依赖于宿主的应答性，通过观察淋巴细胞对多克隆有丝分裂原的增殖反应以及免疫球蛋白得产生，证实了其应答性在对照组、疫苗治疗组中的有反应者和无反应者蛋白质几乎完全相同，从而排除了宿主淋巴细胞对免疫治疗有直接的影响。进一步的研究发现，疫苗治疗的应答同接受前DC的功能有关。在DC功能良好的23只转基因小鼠中，其HBsAg、HBcAg在疫苗治疗后完全转阴，且HBVDNA水平下降；而DC功能不良的19只则完全没有应答。此外，DC功能良好的小鼠，其DC有MHCII、CD86表达的上调及IL-12产生的增加，该研究提示，可通过DC的活化来预测疫苗治疗的效果。
还有人通过小鼠皮下或肌肉注射携带编码病毒抗原基因的裸质粒DNA，也能激发抗病毒的T细胞免疫，其机制可能是使宿主细胞合成外源基因编码的蛋白质，然后被DC摄入、处理和递呈，或者DC摄入质粒，然后合成和处理并递呈外源基因产物。
Shimizu等以HBsAg质粒DNA或BMDC免疫五个品系的HBV Tg鼠，试图在B细胞和T细胞水平打破耐受。结果DNA免疫只诱导了抗-HBs，没有产生特异性CTL；而DC免疫诱导了HBs28-39特异的CTL应答。但是，两种免疫方法均未引起肝细胞炎症及HBV DNA复制抑制，因此认为还需更有效的免疫策略刺激足够强的免疫应答以获得抗病毒的免疫效果。Stober等用HBsAg颗粒体外冲击BMDC及源于脾脏和肝脏的DC，也发现HBsAg能有效进入DC的任何加工途径，并能提呈表位给MHCⅠ类分子限制的特异性CTL。类似方法在临床上也体现了效果。Li等把19位慢性乙肝病人的PBDC体外用HBsAg冲击后皮下注射自体回输，结果有10人血清HBeAg清除，5人有HBeAg/抗-HBe血清转换，HBV DNA拷贝数下降，2名联合用拉米夫丁的病人有完全临床反应，而且ALT水平异常或正常的病人对DC治疗的反应相同。
DNA疫苗虽然可诱导体液免疫和细胞免疫，但由于体内只有十分有限的DNA分子被DC摄取，影响了其免疫效果。You等设计了能表达HBeAg和IgG Fc融合蛋白的DNA疫苗，通过体内表达的IgG Fc和DC表面FcγR结合，促进DC捕获和处理HBeAg的能力，能普遍增强CD4+Th、CD8+CTL和B 细胞应答。
由于MHC-肽复合物半衰期较短，其寿命决定了CTL反应的效率，因此要保持高水平而持久的抗病毒免疫应答需用致敏的DC重复刺激机体。为使DC能持续地递呈病毒抗原多肽，可将病毒抗原多肽基因导入DC，使DC表面能持续表达基因产物，从而有效地诱导出特异性T细胞应答。为达此目的，必须有适合的基因载体。有人将编码荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因的质粒DNA通过聚乙烯亚胺（PEI）结合于腺病毒微粒（Ad）上，转染入DC，发现Ad-PEI-DNA转染复合体产生较高的转导水平，并且能持续表达荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因产物。这种DC也能刺激同种和自体混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖，并且可以抗原特异方式激活T细胞，因为DC表面也有甘露糖受体的高表达。
还有人用甘露糖组成Mam-PEI-DNA复合体，通过甘露糖受体介导和内吞作用转染DC,发现这种复合体传递基因不如Ad-PEI转染有效，而Mam-PEI-DNA转染复合体结合腺病毒则能更进一步增强转导效率和转基因表达，提高病毒基因传递系统的转导效率较非病毒系统更高。其他的载体还有逆转录病毒、疫苗病毒、阴离子蛋白体，或以电穿孔法导入基因。目前认为，腺病毒较其它病毒爱踢能产生更高的转染效率。
另外，Ding等以逆转录病毒为载体给小鼠BMDC转导HBc基因，发现该基因修饰的DC皮下免疫C57BL/6小鼠，能诱导比HBcAg免疫更强的Th1和特异性CTL应答。Hu等用重组腺相关病毒（rAAV）介导HBsAg基因感染人PBDC，同样证实该DC比处女DC在刺激Th1分化上更有效，但DC的表型、IL-12产生等功能不受影响，提示这种DC疫苗可应用于HBV感染的免疫治疗。
有人将编码肿瘤抗原的基因转入DC和成纤维细胞，并与标准的遗传免疫进行比较，一次注射500~1000个转基因DC就可以达到标准遗传免疫的效果，而这需要注射至少50倍的转基因成纤维细胞。因此，少量的DC便可激活大范围的免疫应答。
我们研究所最近的研究结果表明，Ad-S转导的DC能诱导比HBsAg蛋白冲击DC及DNA疫苗更强的I型免疫应答和特异性CTL免疫，对HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏组织HBcAg和HBsAg的表达有较迅速和明显的抑制作用。
目前的研究报道，从慢性乙型肝炎患者的外周血中分离DC，体外扩增同时用匙孔血蓝蛋白和HBsAg等进行刺激，7~9d后回输，试治疗慢性乙型肝炎，结果表明此疗法可促使HBeAg、HBVDNA阴转，肝功能趋于稳定。