【摘要】  眼部新生血管性病变是致盲的主要原因之一，可见于多种眼底疾病，其确切的发病机制尚不完全清楚。大量的研究证据表明血管内皮生长因子（VEGF）是新生血管形成的关键调控因子。本文对VEGF的特性、VEGF在眼部新生血管形成中的作用和抗VEGF治疗进行综述。

【关键词】  新生血管；血管内皮生长因子；治疗

     Anti-vascular endothelial growth factor treatment for ocular neovascularization

    Zheng Liu, Ye-Qing Wang, Xiao-Mei Zhang

    Foundation item: Heilongjiang Provincial Natural Science Foundation, China (No. D200662)

    Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

    Abstract Ocular neovascularization is the primary cause of blindness in a wide range of ocular diseases. The exact mechanism underlying the pathogenesis of ocular neovascularization is not yet well understood. There is extensive evidence that vascular endothelial growth factor (VEGF) is a major regulator of neovascularization. The present paper focuses on VEGF and its role in ocular neovascularization and current anti-VEGF treatment.

    · KEYWORDS: neovascularization; vascular endothelial growth factor; treatment

    0引言

    眼部新生血管（ocular neovascularization）是多种眼部疾病的共同病理改变，如糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）和中心性渗出性脉络膜视网膜病变（central exudative chorioretinopathy, CEC）等，是导致视力障碍的重要原因之一。在正常的眼部血管系统，血管生成促进因子和抑制因子处于平衡状态，维持眼部血管系统的结构及功能[1,2]。然而在缺氧、缺血、炎症和创伤等病理条件下，血管生成促进因子和抑制因子之间的平衡被打破后，将会导致新生血管的形成[3]。新生血管的形成是一个复杂的过程，涉及多种细胞因子的调控，其确切机制目前仍不清楚。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是直接作用于血管内皮细胞的多肽类生长因子，在生理性和病理性眼部新生血管的形成中都起着至关重要的作用[4]。近年来，随着药理学研究和分子生物学研究的进展，许多抗VEGF治疗药物已显示出良好的临床应用前景。

    1 VEGF及其受体

    VEGF是一种对热和酸都相对稳定的糖蛋白二聚体，分子量在46 000～48 000间，其对血管内皮细胞有着特异的促分裂作用。VEGF家族包括VEGF-A（通常简称为VEGF）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子（placental growth factor, PLGF）。Ferrara等1989年首次从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离、提纯。人类VEGF基因定位于6号染色体的p12～p21，由8个外显子和7个内含子组成，全长28kb，目前已被鉴定的4种异构体包括：VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206，通过同一基因转录的mRNA以不同的剪切方式拼接而成。

    VEGF与其特异性受体结合后才能调控血管通透性及内皮细胞的增殖、迁徙。VEGFR主要有两种：VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（Flk-1/KDR），主要在内皮细胞表达，单核细胞和巨噬细胞也有少量表达。这两种受体都是跨膜酪氨酸激酶受体，包含7个免疫球蛋白样的细胞外区域、1个跨膜区和1个细胞内区域。VEGFR与配体结合后，发生自身磷酸化，激活后启动细胞内信号转导系统，导致机体产生分解血管基底膜所需的蛋白酶及整合素。

    2 VEGF与眼部新生血管

    眼部新生血管最常见于角膜、视网膜和脉络膜。参与新生血管形成的细胞因子至少有20多种，包括VEGF、血小板衍生生长因子（PDGF）、肿瘤坏死因子（TNF）、转化生长因子（TGF）等。Michaelson于1954年假设了视网膜可产生一种可扩散的因子，来介导视网膜自身的血管发生。VEGF作为与血管增殖密切相关的生长因子，最符合上述因子的标准。

    2.1 VEGF与角膜新生血管（corneal neovascularization） 角膜是眼球重要的屈光间质之一，没有血管组织。在病理状态下，毛细血管从角膜缘血管网侵入角膜而形成角膜新生血管。引起角膜新生血管最常见的原因是炎症，另外还包括角膜接触镜、免疫反应和碱烧伤等。角膜新生血管虽然能增强角膜防御功能，促进损伤愈合，但角膜新生血管使角膜“相关免疫赦免”偏移消失，严重影响视力。在角膜组织，VEGF表达于上皮细胞层、基质层和内皮细胞层，VEGF的基本表达在维持角膜正常生理功能上起着关键作用[5]。大量研究表明，角膜新生血管的形成与VEGF的过度表达密切相关。在炎症性角膜血管化时，上皮细胞和内皮细胞中的VEGF表达显著增加，特别在瘢痕组织的成纤维细胞和巨噬细胞周围[6]。在鼠的角膜新生血管模型中，VEGF mRNA和蛋白水平与炎症和新生血管呈时空对应关系，并且VEGF中和抗体可以有效地抑制角膜新生血管的形成。

    2.2 VEGF与视网膜新生血管（retinal neovascularization, RNV） RNV一般发生于视网膜大面积缺血、缺氧、微循环障碍的情况下，由缺血、缺氧所导致的RNV被认为主要由VEGF增加引起。VEGF 不仅能使血管通透性增加，还可破坏血—视网膜屏障，导致黄斑部水肿，造成视力障碍。视网膜的多种细胞都可以表达VEGF，但大部分VEGF由Müller细胞和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞产生。早期的研究发现，增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）患者视网膜和玻璃体内VEGF水平显著增高。糖尿病性黄斑水肿（DME）患者房水内VEGF水平升高，并且与DME的严重程度呈正相关。PDR患者在进行视网膜激光光凝后，玻璃体内VEGF水平相应地下降。已有研究证明，VEGF可诱导实验性RNV形成[7]。Alikacem等[8]在兔的玻璃体内置入VEGF缓释装置，诱导出的视网膜病理改变和PDR类似。在缺氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，当RNV发生消退时，VEGF的水平也下降至正常，提示RNV的发生和消退与VEGF的水平密切相关。

    2.3 VEGF与脉络膜新生血管（choroidal neovascul -arization, CNV） CNV也称视网膜下新生血管，是指脉络膜毛细血管形成异常的新生血管，突破Bruch膜进入视网膜下间隙而形成新生血管膜。CNV好发于黄斑区，与脉络膜循环在黄斑处的生理和解剖特征有关。视网膜循环代谢障碍、RPE或Bruch膜损伤是诱发CNV的主要原因。Bruch膜及其周围基质的变化，改变了RPE细胞的基因表达，又导致了CNV的发展。VEGF诱导基质金属蛋白酶（MMPs）、胶原酶和纤维蛋白溶解激活物的表达，促进细胞外基质降解，增加血管通透性，致使血浆蛋白渗漏，为底层内皮细胞的生长提供条件，最终导致新生血管形成。在灵长类动物，玻璃体内注入VEGF可诱导出脉络膜血管内皮细胞增生。Wang等[9]将表达人VEGF165的腺相关病毒载体注射到鼠的视网膜下，2～12mo后95%的鼠发生CNV，并伴随血管渗漏和视功能的下降，表明了VEGF是CNV形成过程中的主要致病因子。

    3抗VEGF治疗药物

    随着研究人员对VEGF作用的认识加深，针对VEGF自身及其信号转导通路的抗VEGF治疗药物已成为当今的研究热点，主要包括抗VEGF适体、抗VEGF单克隆抗体、VEGF Trap、小干扰RNA（siRNA）及VEGFR酪氨酸激酶抑制剂[10]。

    3.1抗VEGF适体（aptamer） Pegaptanib sodium，商品名Macugen，是Eyetech和辉瑞公司联合生产的核酸适体药物，2004年被美国FDA（food and drug administration）批准用于治疗湿性AMD。适体是一种能与多种配体特异、高效结合的RNA或DNA片段。作为VEGF的适体， Pegaptanib 只能结合完整的VEGF165，而不会与其他VEGF异构体或仍有生物活性的VEGF165 裂解片断相结合。Pegaptanib 结合于VEGF的肝素结合区，VEGF165与Pegaptanib结合后就不能再与VEGFR结合, 从而使其无法产生活性。在一项名为VEGF(inhibition study in ocular neovascularization ,VISION)的Ⅲ期临床试验中，对1 186例CNV患者分别给予Pegaptanib 0.3，1.0，3.0mg玻璃体内注射和虚假注射，每6wk注药一次，共治疗48wk。在48wk时结果显示，各剂量组与虚假注射组均有统计学差异（P分别为<0.001，<0.001，<0.03）。Pegaptanib也显示出良好的安全性，0.7%的患者出现晶体状损伤，仅0.6%的患者发生视网膜脱离。随后2a的随访中，Pegaptanib有效地降低了进展性视力下降的患者比例[11]。在最近结束的一项Ⅱ期临床试验中，62%的DR患者在玻璃体内注射Pegaptanib后出现了新生血管的消退，表明Pegaptanib对DR患者的新生血管有直接抑制作用[12]。

    3.2抗VEGF单克隆抗体 Bevacizumab，又称rhuMAb，商品名Avastin，是人源化的抗VEGF 重组鼠单克隆抗体。Bevacizumab对VEGF-A 的所有亚型都具有亲和力，其抗新生血管的主要机制为阻止VEGF 与内皮细胞表面的VEGFR-1和VEGFR-2受体结合，从而使内源化VEGF 的生物活性失效。Bevacizumab作为首个批准上市的VEGF 抑制剂，用于转移性结直肠癌的治疗，对眼科疾病的治疗尚处于临床试验阶段，但已显示出良好的疗效。Avery等[13]给予79例AMD患者玻璃体内注射1.25mg的Bevacizumab，每月给药一次，15wk后OCT显示视网膜厚度变薄，多数患者CNV区荧光渗漏减少，未出现严重的眼部及全身副作用。玻璃体内注射Bevacizumab不仅对CNV 有效，对眼内其他部位的新生血管以及黄斑水肿也有一定的抑制效果[14,15]。

    Ranibizumab，又称rhuFabV2，商品名为Lucentis，于2006-06获得美国FDA批准，是第二代人源化的抗VEGF 重组鼠单克隆抗体片断。Ranibizumab是由Bevacizumab的部分抗体片断衍生加工而成，能够结合并抑制VEGF所有的活性异构体及其降解产物，可以完全渗透视网膜全层[16]。MARINA（minimally classic/occult trial of the anti- VEGF antibody Ranibizumab in the treatment of neovascular AMD）为一项为期2a的多中心、随机、双盲的Ⅲ期临床试验，轻微典型性或隐匿性CNV患者每月接受一次玻璃体内注射Ranibizumab（0.3mg或0.5mg）治疗，对照组则仅行虚假注射。1a后的结果显示，与对照组比较，治疗组95%的患者视力下降少于15个字母（P <0.001）。Ranibizumab阻止了CNV 的生长，并对血管渗漏具有抑制作用[17]。

    3.3 VEGF Trap VEGF Trap是Regeneron公司基于Trap技术平台开发的一种强力VEGF 阻断剂，是一类包含VEGFR-1 和VEGFR-2细胞外区的融合蛋白。VEGF Trap与单克隆抗体相比，对VEGF有着更强的亲和力，理论上在较低剂量时就能产生极大的药效。Cursiefen等[18]观察到VEGF Trap能够明显地减少鼠在角膜移植术后角膜新生血管的形成，并有效地延长了移植物的存活时间。2006年，ARVO（association for research in vision and ophthalmology）年会上公布了VEGF Trap的Ⅰ期临床试验，对25例AMD患者每2wk静脉注射一次不同剂量的VEGF Trap（0.3，1.0，3.0mg/kg）或安慰剂，结果显示视网膜厚度的下降呈剂量依赖性，但患者的血压也与注射剂量呈正相关。目前正在进行的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，将评估玻璃体内注射VEGF Trap治疗AMD的疗效及安全性，VEGF Trap有望成为治疗AMD和DME的新药。

    3.4 siRNA RNA干扰（RNAi）是一种高度序列特异性的、保守的转录后基因沉默，是由siRNA诱导引起的同源性基因抑制。siRNA由21～23个核苷酸组成，通过结合与其有互补序列的mRNA并使其降解来达到靶基因表达的目的。选用针对VEGF的 siRNA可以特异性地抑制VEGF基因表达，引起细胞内VEGF的长期下调，而不是阻断已表达的VEGF。siRNA与适体相比，不仅分子更小，在体内的半衰期有可能更长。研究证实，一些利用siRNA技术开发的药物如Cand5和ALN-VEG01，在体内外的缺氧条件下均可以降低VEGF的表达[19]。Ⅰ期临床试验的结果显示，Cand5的剂量在3.0mg时安全性和耐受性最佳。常见的副作用包括结膜下出血、眼痛和玻璃体漂浮物。针对Cand5的Ⅱ期临床试验尚在进行中，尚未出现任何严重的药物副作用及毒性反应的报道。

    3.5 VEGFR酪氨酸激酶抑制剂 VEGFR的酪氨酸激酶域是VEGF信号转导的起点，该域的活性通过受体和配体的结合而被激活，阻断该位点可以有效的抑制VEGF介导的血管生成作用， VEGFR酪氨酸激酶抑制剂可能比以VEGF作为靶点的药物更为有效。在缺氧诱导的鼠RNV模型中，每日玻璃体内注射PTK787可以减少增殖性视网膜病变[20]。针对VEGFR酪氨酸激酶设计筛选出的药物初期临床试验结果都较理想，显示出良好的药物动力学特性。如PTK787/ZK222584可以抑制所有已知的VEGFR酪氨酸激酶，正在进行两个大型的国际多中心、随机、安慰剂对照的Ⅲ期临床试验。

    4结语

    总之，VEGF的表达与眼部新生血管形成有着密切的时空对应关系，VEGF及其受体一直是近几十年眼部新生血管研究的中心环节。抗VEGF治疗作为一种特异性和靶向性强的治疗手段，无疑为眼部新生血管性疾病的治疗提供了一条新途径。未来的临床试验也将评估联合应用抗VEGF治疗药物的可能性，以期降低药物剂量、延长药物作用时间并减少毒副作用。

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