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血管内皮生长因子反义寡核苷酸联合低分子肝素治疗小鼠膀胱癌

2010-08-24 13:19:23 作者：新特药房来源：吉林大学第二医院泌尿外科，麻醉科浏览次数：55 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的探讨血管内皮生长因子（vegf）反义寡核苷酸和低分子肝素法安明单用或联合对小鼠膀胱癌、转移的抑制作用。方法制备小鼠膀胱癌模型40只，随机分为对照组、vegf反义寡核苷酸（asodn）组、 ...

【摘要】
目的探讨血管内皮生长因子（vegf）反义寡核苷酸和低分子肝素法安明单用或联合对小鼠膀胱癌、转移的抑制作用。方法制备小鼠膀胱癌模型40只，随机分为对照组、vegf反义寡核苷酸（asodn）组、vegf错义寡核苷酸（msodn组）、低分子肝素（lmwh组）及联合治疗组，每组8只，分别给予生理盐水、vegfasodn、vegfmsodn、法安明及vegfasodn+法安明皮下注射，隔日1次，共15次。检测皮下移植瘤变化和盆腔淋巴结转移率；应用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织微血管密度（mvd）；应用western印迹的方法检查肿瘤组织vegf蛋白表达。结果msodn、asodn、lmwh和联合治疗组的抑瘤率分别为2.1%、33.6%、20.1%和45.3%；盆腔淋巴结转移率分别为62.5%、25%、25%和12.5%；western印迹法检测显示，对照组和msodn组表达较高水平的vegf；asodn组和联合治疗组mvd分别为（11.34±3.03）和（10.01±1.25），与对照组（21.23±4.01）和msodn组（18.21±3.36）相比，差异有统计学意义（p<0.01）；lmwh组mvd为（13.04±6.53），较对照组和msodn组降低，差异有统计学意义（p<0.05）。结论vegfasodn和法安明具有下调vegf表达，抗血管生成作用；两者联合应用有协同抗肿瘤作用。

【关键词】膀胱癌；血管内皮生长因子；低分子量肝素

effect of vegf antisense oligonucleotide combined with low molecular weight heparin on the growth and metastasis of mice bladder cancerfan haitao,wang xiuyan,chai hongmei,liu lucheng

department of urology,the second hospital of jilin university, jilin 130041,china，department of anesthesiology

abstract：objective to investigate the inhibitory effect of vascular endothelial growth factor(vegf) antisense oligonucleotides or/and dalteparin sodium(fragmin) on tumor growth and metastasis of mice bladder cancer. methodsforty mice with bladder cancer were randomizedly divided into five groups:control group,vegf antisense oligonucleotides(asodn) group,vegf mismatch sense oligonucleotides(msodn) group,low molecular weight heparin (lmwh) group,and combined group.sodium chloride,vegfasodn,vegfmsodn,fragmin,and vegfasodn plus fragmin were given respectively(once every two days,15 times altogether).the volume and weight of subcutaneous tumors were measured,and the rate of pelvic lymphonode metastasis were detected by he staining.the microvessel density(mvd) in tumor mass was measured by immunohistochemistry staining.vegf protein level in tumor tissue was detected by western blot assay. resultsafter treatment,the tumor growth inhibitory rates were 2.1%,33.6%,20.1% and 45.3%,and the rate of pelvic lymphonode metastasis were 62.5%, 25%,25% and 12.5% in msodn, asodn,lmwh,and the combined group,respectively.western blot indicated that there was high level vegf in msond and control group.mvd of msodn,asodn,lmwh,the combined group and control group was (18.21±3.36), (11.34±3.03), (13.04±6.53), (10.01±1.25) and (21.23±4.01). difference was significant. conclusionvegfasodn and fragmin may downregulate vegf gene expression and inhibit angiogenesis.combined use of fragmin can enhance antiumor effect of vegfasodn.

key words：bladder cancer; vascular endothelial growth factor; ｌow molecular weight heparin

引言

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）是目前已知活性最强的血管生成因子，可促进肿瘤血管生成，并导致肿瘤对化疗药物产生耐药，与肿瘤患者的预后密切相关[1]，因此，vegf已成为理想的抗血管生成治疗的靶点[2]。研究发现vegf及受体的单克隆抗体对一些肿瘤具有一定疗效，但伴由血栓形成、出血倾向和高血压等并发症[3,4]。低分子肝素（low molecular weight heparin，lmwh）可预防和治疗肿瘤伴发的高凝血症和静脉血栓栓塞症[5]。我们已经设计合成vegf反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，asodn）和错义核苷酸（mismatch sense oligonucleotide，msodn）[6]，现将vegfasodn和低分子肝素法安明单用或联用治疗荷膀胱癌小鼠，探讨两者对肿瘤生长和转移的抑制作用及其相关机制。

1材料与方法

1.1主要试剂法安明（fragmin，dalteparin sodium injection）由辉瑞制药有限公司惠赠；ⅷ因子相关抗原（factor ⅷrelated antigen）一抗，pv9000试剂盒，vegf鼠多克隆抗体igg，美国zymed公司产品。

1.2荷膀胱癌小鼠模型的建立人膀胱移行细胞癌系t24购自中科院上海分院细胞所；雌性c57bl近交系小鼠，6周龄，体重（20±2）g，二级清洁动物，由吉林大学实验动物中心提供。参见文献[7]。用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式体积=π/6×长×宽×高，计算肿瘤体积。取每组平均数。

1.3实验动物分组c57bl小鼠40只，随机分成5组，每组8只，接种后16h分组给药：（１）对照组：生理盐水100μl/次，环瘤皮下注射；（２）asodn组：vegfasodn 100μl/次（33μg/次），环瘤皮下注射；（３）msodn组：vegfmsodn 100μl/次（33μg/次），环瘤皮下注射；（４）lmwh组：法安明100μl/次（20iu/次），对侧下肢皮下注射；（５）联合治疗组：vegfasodn 100μl/次（33μg/次），环瘤皮下注射，法安明100μl/次（20iu/次），对侧下肢皮下注射，各组用药均隔日1次，共给药15次。观察实验期间小鼠进食、精神及活动状态。治疗结束处死动物，称瘤重。采用公式：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.4组织病理学检查取10%甲醛溶液固定的小鼠肺、心、肝、脾、肾、肾上腺、胰、脑、胃、肠、盆腔淋巴结等，按各脏器正中最大切面取材。石蜡切片，制作病理组织切片，he染色光镜下观察和计算各脏器内有无转移瘤、转移瘤灶的数量、分布及观察各脏器有无出血改变。

1.5肿瘤组织微血管密度（mvd）的免疫组织化学检测采用三步法，以生理盐水代替一抗做阴性对照，mvd计数按文献[8]的方法，微血管的计数标准：ⅷ因子相关抗原阳性的单个细胞、一个细胞簇、血管干上的分支结构，以上情况均作为一支血管。

1.6western印迹检测vegf蛋白表达取肿瘤组织1g，在冰上剪碎，以1∶4的比例加入蛋白抽取液（10mmol/l nahco3，1mmol/l pmsf，1μg/l aprotinin），以2000r/min 匀浆30s×2后，于4℃，10000g离心30min，收集上清，bradford方法蛋白定量。取100μg总蛋白和适量标准蛋白分子量混合物，加入缓冲液，调整体积在40μl，100℃变性3min后，用sdspage凝胶蛋白电泳分离蛋白，再将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素滤膜转到丽春红液染色2min。蛋白带出现后，于室温用去离子水冲洗硝酸纤维素滤膜5min，软铅笔标记出标准蛋白分子量的位置。把硝酸纤维素滤膜放入面积大小相近的塑料盒中，用5%脱脂奶封闭后，按滤膜面积大小加入vegf鼠多克隆抗体igg，置摇床平台于室温孵育4h，用tbs洗涤3次，每次30min。按滤膜面积加入含辣根过氧化物酶标记的二抗，室温平缓摇动敷育1～2h，用tbs洗涤3次，每次30min。dab显色。实验重复3次，用hp 3770扫描仪扫描得到显色的蛋白带图像。

1.7数据统计与分析所有统计分析均采用spss 10.0统计软件完成。各治疗组不同时间肿瘤体积大小比较采用重复测量方差分析；各治疗组瘤重、微血管密度比较采用单因素方差分析，两两比较采用lsd检验。

2结果

2.1对肿瘤生长的抑制作用小鼠对治疗的耐受性较好，各组小鼠未见出血及其他的药物副作用，实验结束前无小鼠死亡。治疗后asodn组、lmwh组和联合治疗组小鼠的体重，较治疗前增加（p<0.05）。接种后9天全部小鼠成瘤，成瘤率为100%。对照组和msodn组小鼠成瘤率早，瘤体进行性增大；asodn组和联合治疗组成瘤时间较晚，肿瘤生长明显受抑制（p<0.01）。各治疗组瘤重及抑瘤率的比较见表1。

2.2肿瘤组织的病理学检查he染色光镜下观察，各组肿瘤细胞均大小不等，胞浆丰富，核大、深染、大小不一，细胞形态间无明显区别。asodn组、联合治疗组及lmwh组瘤组织中有大量的坏死灶，边缘作用明显，细胞核溶解、破碎，细胞间质少于对照组和msodn组。

表1各组间瘤重和抑瘤率的比较（略）

2.3对肿瘤转移的影响：he染色光镜下观察，可见盆腔淋巴结转移，余脏器未见转移，见表2。各脏器均未见出血。各组与对照组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。

表2肿瘤盆腔淋巴结转移的比较（略）

2.4各组间肿瘤组织mvd比较asodn组和联合治疗组mvd分别为（11.34±3.03）和（10.01±1.25），与对照组（21.23±4.01）和msodn组（18.21±3.36）相比，差异有统计学意义（p<0.01）；lmwh组mvd为（13.04±6.53），较对照组和msodn组降低，差异有统计学意义（p<0.05）。

2.5各组间肿瘤组织vegf蛋白的表达western印迹法检测显示，对照组和msodn组表达较高水平的vegf，asodn组和联合治疗组可明显下调vegf的表达，见图1。

m：标准参照物；l1：asodn组；l2：lmwh组；l3：msodn组；l4：asodn+lmwh组；l5：对照组

图1western印迹检测肿瘤组织中vegf的表达（略）

3讨论

近年来肿瘤的基因治疗使肿瘤的治疗进入崭新的领域，基因治疗具有不易产生耐药性、不受肿瘤细胞周期限制、特异性强及对原发肿瘤和转移瘤均有良好疗效等优点。反义技术主要包括asodn、反义rna、核酶（ribozyme）和三螺旋dna 4类，其中以asodn的研究最为活跃[9]。研究表明vegf反义寡核苷酸在体内和体外均可减少vegf mrna的表达及vegf蛋白的合成，从而减少血管内皮细胞增殖[10]。用asodn封闭基因表达是基因治疗的重要方法之一，目的是在mrna水平通过调节基因表达来调控下游的引发疾病蛋白的表达。采用环瘤皮下给药，目的是提高局部寡核苷酸作用的浓度。

法安明是普通肝素经化学或酶促解聚后分解而成的分子量在4000到6000之间的化合物，与普通肝素相比，具有更高的抗xa/抗ⅱa的比值，更强的抗血栓形成作用，更高的皮下注射生物利用度，更长的血浆半衰期，更小的出血可能性等特点。本文研究结果显示，与对照组相比，asodn组和联合治疗组明显抑制了肿瘤的生长，以联合治疗组为著；msodn组无抑瘤作用；lmwh组一定程度上抑制肿瘤的生长。

提示vegfasodn具有特异性地抑制膀胱癌生长的作用；法安明具有一定的抗肿瘤作用，但效果不如vegfasodn；联合治疗能起到协同的抗肿瘤作用。实验期间联合治疗组、asodn组和lmwh组小鼠体重较治疗前增加，无小鼠死亡，提示3组治疗的毒副作用小，小鼠生存质量提高。各组小鼠均发生盆腔淋巴结转移，asodn组和lmwh组与对照组相比有下降趋势；联合治疗组相比其他组显示出了较强的抑制转移趋势。结合前人研究[11]，可推测vegfasodn和法安明具有抑制肿瘤转移的趋势，两者联合有协同抗转移作用。对肿瘤组织进行he染色和mvd检测，发现各组细胞形态无明显改变，asodn、联合治疗组及lmwh组肿瘤间质血管减少，可以推断vegfasodn和法安明可能通过抑制间质血管生成，进而抑制肿瘤生长,不是直接杀伤肿瘤细胞。结合western blot检测vegf蛋白表达结果，推测vegfasodn能特异地下调肿瘤组织中vegf的表达；法安明具有潜在下调vegf表达的作用，两者联合应用具有协同下调vegf表达、抗血管生成的作用，故两者联合表现出协同抗肿瘤生长和转移的作用。膀胱癌的高发病趋势及易复发进展的特性决定了早期诊断和合理有效治疗的重要性[12]。我们的研究结果表明通过抑制vegf的表达来抑制膀胱癌血管形成达到治疗膀胱癌的方法是有效的，从而可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。