【摘要】  眼底新生血管是多种眼病的并发症，研究发现促进眼底新生血管发生发展的最主要的因子是血管内皮生长因子,在这些眼病的病理过程中血管内皮生长因子表达上调，表达上调的血管内皮生长因子引起脉络膜或视网膜的新生血管。目前缺少针对眼底新生血管的有效的早期治疗手段，一系列下调或阻断血管内皮生长因子或其受体的药物和抑制二者结合后生物学效应发挥的药物已成为治疗眼底新生血管研究的热点之一。

【关键词】  血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；眼底新生血管

     Vascular endothelial growth factor and its receptors in choroid and retinal neovascularization

    Hong-Wei Zhou, Qiang Wu

    Foundation item: "Climbing Mountain" Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, China (No.064119543)

    Department of Ophthalmology, the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China

    Correspondence to: Hong-Wei Zhou. Department of Ophthalmology, the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China. zhouhongwei@sjtu.edu.cn

    Received:2007-03-29 Accepted:2007-06-04

    Abstract Choroid and retinal neovascularization are the complications of several types of ophthalmopathy, and current researches discover that the most important enhancing factor of choroid and retinal neovascularization is vascular endothelial growth factor (VEGF). The expression of VEGF is up-regulated in these diseases, and up-regulated VEGF can induce choroid and retinal neovascularization. At present effective early treatment method of choroid and retinal neovascularization is deficiency. One of the focuses in treating choroid and retinal neovascularization is researches on drugs which can either down-regulate or block VEGF as well as its receptors, or suppress the biological effects of VEGF after binding to its receptors.

    · KEYWORDS: vascular endothelial growth factor; vascular endothelial growth factor receptor; choroid and retinal neovascularization

    0引言

    眼底新生血管是多种眼病的严重并发症，如糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy DR）、早产儿视网膜病( retinopathy of prematurity ROP)、年龄相关性黄斑病变( age-related macular degeneration AMD)等，严重影响视力，甚至致盲。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)也曾被称为VPF（vascular permeability factor）和VAS(vaculotropin)，是调节血管功能、促进新生血管的重要因子，在肿瘤生长、糖尿病视网膜病变、创伤愈合等方面一直得到广泛的研究。随着社会的发展和人民生活水平的提高，眼底新生血管疾病也越来越受到重视，针对血管内皮生长因子的研究进展迅速，因而有必要进一步对血管内皮生长因子及其受体与眼底新生血管的相关领域进行探讨,以利于对该方面进展的了解和前沿性研究。

    1 VEGF及其受体

    1.1 VEGF及功能 1983年Senger发现一种蛋白质注射到豚鼠的皮内可引起血管通透性增高，将这种蛋白质命名为血管通透因子(VPF)，后来证实VPF即VEGF。VEGF的基因定位于6p21.3,长约14kb,由8个外显子和7个内含子构成，其mRNA由于第8个外显子剪切方式不同可以翻译出两大类异构体VEGFxxx和VEGFxxxb，VEGFxxx促进新生血管，而VEGFxxxb抑制新生血管[1]。VEGFxxx是以二硫键连接的二聚体糖蛋白，分子量为35000～45000Dal。VEGFxxx家族成员包括PIGF（placenta growth factor）,VEGF-B,VEGF-C和VEGF-D。VEGFxxx基因可翻译出五种异构体VEGF121, VEGF145, VEGF165,VEGF189, VEGF206。VEGF有提高血管通透性、促进内皮细胞迁移增殖和血管形成、改变胞外基质、上调细胞间粘附分子－1(ICAM-1)的表达、增加内皮细胞对葡萄糖的转运、抑制内皮细胞凋亡等功能。此外VEGF具有神经细胞保护作用，可以促进原代培养的大鼠大脑皮层神经元的轴突再生和生长[2]；VEGF对红细胞生成具有调节作用，有效阻断VEGF发挥效应将导致肝合成促红细胞生成素增加，从而促进红细胞生成[3]；Hashimoto等[4]研究发现VEGF可以诱导鸡视网膜的祖细胞增生，并抑制视网膜神经节细胞的产生；Rufaihah等[5]发现VEGF可以使人胚胎干细胞定向分化为内皮细胞。

    1.2 VEGF受体及功能 VEGF受体主要有Flt-1（VEGFR-1）、KDR/Flk-1（VEGFR-2），其它的VEGF受体包括flt-4（VEGFR-3）、neuropilin-1、neuropilin-2等。Flt-1和KDR/Flk-1在结构上都包括胞外的免疫球蛋白样结构域、单跨膜区和胞内的酪氨酸激酶序列，功能上Flt-1对VEGF的亲和力比KDR/Flk-1高出一个数量级。KDR/Flk-1在促进血管内皮细胞有丝分裂和化学趋化作用的过程中发挥作用，而在此过程中Flt-1的作用像竞争性抑制受体；Flt-1功能比较复杂，有研究发现Flt-1参与VEGF介导的单核细胞迁移和抑制树突细胞形成，抑制KDR/Flk-1介导的细胞增殖，调节胚胎期VEGF水平等过程。

    1.3 VEGF及受体在眼中的分布 VEGF及其受体在正常眼中即有表达。Ivana等[6]用原位杂交、northern blot等方法探测猴和大鼠眼球中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表达和分布情况，发现VEGFmRNA在正常有血管的猴眼球组织中稳定的表达，如结膜、虹膜、视网膜、脉络膜-视网膜色素上皮复合体；VEGF则在结膜、视网膜和脉络膜-视网膜色素上皮复合体中被探测到；在视网膜上VEGF定位于神经节细胞层、内核层、视网膜色素上皮细胞层，VEGFmRNA定位于神经节细胞层、内核层、视网膜色素上皮细胞层，光感受器细胞层；VEGFR-1mRNA和VEGFR-2mRNA在正常虹膜、视网膜、络脉膜-视网膜复合体中表达；在视网膜上，VEGFR-1mRNA和VEGFR-2mRNA都定位于内核层。Lutty等[7]用免疫组化的方法探测发现：正常人的视网膜、脉络膜血管中有少量VEGF表达，并且VEGF的免疫反应与血管内白细胞呈相关性，视网膜的血管内皮细胞、周细胞、色素上皮细胞、Müller细胞都可分泌VEGF。

    1.4 VEGF及受体的调控因素 VEGF及其受体表达的调控因素众多，它们可作用于多种细胞调节VEGF及其受体表达。这些因素通过影响相关胞内介质如激酶、癌基因、抑癌基因、转录因子等，在转录及转录后水平调控VEGF及其受体。通过一系列研究发现上调VEGF表达的因素主要有缺氧及缺氧诱导因子HIF、环氧化酶2、转录因子AP-1、癌基因Ras和Src的产物、神经因子HLF、雌激素、前列腺素E2、白介素6等。下调VEGF表达的因素主要有抑癌基因P53的产物、肿瘤抑制蛋白VHL、小板衍生生长因子等。上调VEGF受体表达的因素主要有缺氧、VEGF、碱性成纤维细胞生长因子等。下调VEGF受体表达的因素主要有转化生长因子β1、肿瘤坏死因子等。其它的调节VEGF及其受体的因素有：一种新发现的蛋白质Vasohibin可能在VEGF介导的新生血管形成过程中起负反馈调节作用，VEGF表达增加可上调Vasohibin的表达,Vasohibin进而下调KDR/Flk-1的表达并抑制其发挥作用负反馈的调节新生血管形成[8]；一氧化氮在正常氧分压状态下上调HIF表达从而增加VEGF的表达 [9]；色素上皮衍生因子（PEDF）阻遏活性氧簇（ROS）介导的VEGF表达[10]；血管紧张素可以上调VEGF表达[11]；胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)上调VEGF的表达[12]；骨形成蛋白-4（BMP-4）可上调培养的视网膜色素上皮细胞的VEGF分泌量[13]；白介素17促进类风湿关节炎的滑膜细胞表达VEGF[14]；乳铁蛋白可以上调培养的人脐静脉血内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA和蛋白表达[15]；全反式维甲酸通过抑制ERK1/2信号转导通路，进而抑制紫外线导致的皮肤角质细胞的VEGF表达等[16]。

    2 VEGF及其受体在眼底新生血管病理过程中表达的变化及相关机制

    研究发现糖尿病大鼠视网膜中VEGFmRNA表达显著增多，增多的VEGFmRNA主要分布于视网膜神经节细胞层、内核层，在视网膜色素上皮层中VEGFmRNA的表达则没有显著变化；在正常大鼠和糖尿病大鼠视网膜中VEGFR-1mRNA和VEGFR-2mRNA呈相似的分布状态,VEGFR-1mRNA出现在视网膜内界膜下、神经节细胞层、内核层、外丛状层、外界膜，它在视网膜中的表达和分布不受糖尿病视网膜病变的影响；VEGFR-2mRNA分布于内核层和RPE细胞层，在糖尿病视网膜病变中相对增多的VEGFR-2mRNA主要局限于内核层[17]。Frank等[18]对手术切除的由AMD引起的脉络膜新生血管、由增生性DR引起的视网膜新生血管进行免疫组化染色后在光镜下观察，发现所有脉络膜新生血管、视网膜新生血管中VEGF表达均有增加。Kvanta等[19]对手术切除的共18眼的由AMD引起的脉络膜新生血管分别进行原位杂交和免疫组化染色，分析VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达，几乎所有标本均表达VEGF和其mRNA，VEGFmRNA表达水平在炎症反应区域较高，VEGF蛋白则较多的表达在成纤维细胞和炎细胞周围。此外伴有脉络膜新生血管的AMD患者患眼玻璃体中的VEGF水平与正常人相比显著升高[20]。在DR病理过程中，VEGF及其受体表达上调的诱发因素众多，其中缺氧是上调VEGF及其受体表达的重要因素，高血糖引起的一系列生化代谢的改变也是VEGF表达增加的重要原因，这些代谢方面的改变主要有高级糖化终产物的产生 、甘油二酯从头合成途径及蛋白激酶C的激活、多元醇途径的活化、NADH代谢失衡等[21]。在AMD病理过程中VEGF表达增加的原因不明，但缺氧很可能是重要的原因。

    3 VEGF及其受体在眼底新生血管病理过程中的作用

    微循环异常是糖尿病视网膜病变的基础，在诸多引起微循环异常的因素中VEGF处于关键地位，而且VEGF也是促进新生血管的最重要的因子。GK大鼠是一种自发性糖尿病大鼠，对其眼内的VEGF水平用高敏感性ELISA检测发现，在可观察到的视网膜病变发生前，眼内VEGF水平已有升高，用免疫组化的方法观察到增多的VEGF主要在脉络膜、视网膜色素上皮层、视网膜神经纤维层产生，提示VEGF对单纯性糖尿病视网膜病变具有重要的促进作用[22]。胡春玲等[23]用免疫组化的方法探讨了VEGF在正常大鼠眼和注射链脲菌素制作的糖尿病大鼠动物模型眼中的表达情况，发现MMP-3和VEGF在正常大鼠视网膜中没有表达，而在糖尿病视网膜病变大鼠视网膜的内界膜均呈阳性染色反应，VEGF还在糖尿病大鼠视网膜的内核层有弱阳性表达，提示MMP-3和VEGF可能在糖尿病视网膜病变中起重要作用，且二者之间存在协同关系。Aiello等[24]对164例内眼手术患者眼球房水中VEGF进行定量分析，发现在增生性糖尿病视网膜病变眼球房水中VEGF表达水平有升高现象，且VEGF表达水平的升高和增生性DR的发生显著相关，提示VEGF在DR的视网膜新生血管中的重要促进作用[25]。刘庆淮等[26]收集糖尿病不伴有眼底改变合并白内障和糖尿病伴有视网膜病变合并白内障患者的前房液标本，并以无糖尿病白内障患者的前房液作为对照，用酶联免疫吸附实验的方法测定了前房液中VEGF的含量，结果发现和对照组相比糖尿病患者眼前房液中VEGF的含量均显著增加，并且其含量随着糖尿病视网膜病变的进展而增高。Boulton等[27]也认为不论在临床前期DR还是在增生期DR的发生发展中，VEGF都居于关键地位。Wang等[28]用腺相关病毒介导VEGF于大鼠视网膜下间隙表达，95%接受基因转移治疗的大鼠产生了脉络膜新生血管，从而建立了一种脉络膜新生血管动物模型，同时也证明VEGF的高表达足以导致脉络膜新生血管，可见VEGF在AMD引起的脉络膜新生血管中也发挥着重要的促进作用。

    4 VEGF及其受体相关的眼底新生血管治疗药物开发进展

    4.1抗VEGF及其受体抗体 大量实验证明抗VEGF及其受体的单克隆及多克隆抗体均可以抑制VEGF诱导的新生血管形成。如Bevacizumab是一种重组抗VEGF单克隆抗体，作为一种新药已经由FDA批准上市，用于抑制肿瘤的新生血管。Bevacizumab抑制近视引起的脉络膜新生血管、囊样黄斑水肿[29]和年龄相关性黄斑病变[30]新生血管的作用已经得到验证。目前已有Bevacizumab应用于治疗DR的尝试，Bakri等[31]发现玻璃体内注射Bevacizumab可以使DR患者视盘的新生血管快速消退，Spaide等[32]将玻璃体内注射Bevacizumab用于玻璃体出血合并DR的治疗，接受治疗的两名患者第1wk内视力均有提高，1mo后两名患者的视网膜新生血管出现消退。Ranibizumab是48kDa大小的人源化的抗VEGF单克隆抗体，它可以结合所有的VEGF异构体，Ⅲ期临床实验正在进行中，主要用于抑制AMD新生血管形成，一项关于Ranibizumab治疗AMD的为期2a的双盲对照多中心临床实验已经完成，证明Ranibizumab可以阻止AMD患者视力的丧失并能改善平均视力 [33]。

    4.2结合VEGF的重组受体 用Flk-1或Flt-1与IgG的嵌合受体或可溶性Flt-1受体抑制肿瘤新生血管、增生性视网膜病变新生血管、角膜新生血管的研究在上世纪90年代已经出现。Aiello等[34]发现，将人Flt-1受体或鼠Flk-1胞外配体结合域与IgG连接成嵌合受体，在体外抑制了VEGF或缺氧引起的视网膜内皮细胞增生，但对正常生长的内皮细胞没有影响，这种嵌合受体在体内也能显著抑制视网膜新生血管。此后各种嵌合受体都得到广泛的研究,包括VEGFR-1的前3个Ig区和IgG1的Fc段嵌合受体、由VEGFR-1的第2个Ig区和VEGFR-2的第3个Ig区的嵌合受体VEGF-TrapR1R2等。经静脉途径给药，用VEGF-Trap治疗新生血管性AMD的研究已进入期临床试验阶段，这种嵌合受体包括VEGFR-1和VEGFR-2的结合区，目前已确定VEGF-Trap经静脉途径给药的最大耐受剂量为1.0mg/kg[35]。Nirbhai等[36]开发的VEGF重组胞内受体，在体外抑制了由缺氧造成的角膜新生血管，在体内实验中也抑制了碱灼伤和机械刮伤引起的角膜新生血管，为治疗眼底新生血管提示了新的思路。Ideno等[37]用AAV介导可溶性flt-1基因局部转移到视网膜下间隙，观察其对自发性糖尿病大鼠DR的治疗作用，30wk后，用荧光造影的方法观测自发性糖尿病大鼠DR的进展，发现治疗组与对照组相比无血管区、荧光渗漏和动脉狭窄都显著减少。

    4.3 VEGF特异性aptamer Aptamer是一种从随机序列库中筛选出来的特殊的寡核苷酸，可以特异性的结合其它小分子物质，如蛋白质和核酸。Macugen(pegaptanib sodium)是一种化学合成的寡核苷酸链，属于aptamer的一种，能特异性的结合VEGF165，2004-10已获FDA批准应用于临床，治疗AMD的脉络膜新生血管。一项为期2a的多中心临床实验发现眼内注射Macugen常见的副反应轻微且与注射过程有关，未发现注射Macugen可以引起死亡、严重的眼内炎、白内障、青光眼等，在注射Macugen第1a内严重的不良反应有眼内炎、视网膜脱离和外伤性白内障,所有这些不良反应都与违反注射规则有关，在第2a内没有眼内炎、外伤性白内障发生，仅有4例患者（占参与实验总人数的0.15%）发生孔源性视网膜脱离[38]。Adamis等[39]通过随机、对照、多中心临床实验研究了Macugen对DR新生血管的治疗作用，172个志愿者接受了安慰剂注射或者玻璃体内Macugen注射，大部分患有视网膜新生血管的患者在接受Macugen治疗后36wk出现了新生血管的消退，此项研究提示macugen对DR引起的视网膜新生血管也有直接的抑制作用。

    4.4反义寡聚核酸 反义寡聚核酸通过与VEGFmRNA的互补结合可以阻遏其翻译，减少VEGF的生成。如Robinson等[40]发现VEGF的反义硫磷酰寡聚DNA对VEGF的表达有抑制作用，可以较好的抑制视网膜新生血管。Lai等[41]构建编码反义VEGFmRNA的重组腺病毒载体，前房注射重组载体到角膜新生血管动物模型，能显著抑制VEGF的表达和角膜新生血管。曹晖等[42]用脂质体包埋反义VEGFmRNA质粒，注射入视网膜新生血管小鼠玻璃体腔内，显著减少视网膜新生血管，并减少了给药次数，延长了半衰期，为DR治疗提示了新的思路。

    4.5小干扰核酸 小干扰核酸(SiRNA,small interfering RNA)一般有21~23个核苷酸构成，可以直接在哺乳动物体内引起RNA干预，而且具有高效和专一性强的特点。在治疗眼底新生血管领域，RNA干扰同样得到广泛研究。如Reich等[43]构建了VEGF特异的SiRNA，发现SiRNA能在体外实验中显著的抑制缺氧造成的VEGF表达增加，在体内实验中显著减少了腺病毒介导的VEGF表达，并且有效抑制了激光光凝导致的VEGF表达增加和脉络膜新生血管。Irna-027是一种针对VEGFR-1的SiRNA，Shen等[44]发现它显著下调大鼠视网膜新生血管模型和脉络膜新生血管模型的VEGFR-1mRNA水平，并且显著减轻了视网膜和络脉膜新生血管。由于小干扰核酸是一种祼RNA，怎样保持其稳定性必将成为研究热点，构建能稳定表达SiRNA的载体是重要的解决方法之一。如Kim等[45]应用了一种新的SiRNA载体,其主体是一种聚电解质络合物颗粒，SiRNA通过二硫键与聚乙二醇（PEG）相连，SiRNA-PEG通过与阳离子聚乙烯亚胺相互作用形成聚电解质络合物颗粒，该颗粒携带的SiRNA有效的使前列腺癌细胞表达的VEGF在转录后水平沉默，最佳抑制效率可达96.5%，即使在有血清存在的情况下，携带SiRNA的此载体也表现了较强的VEGF基因沉默效果。蔡春梅等[46]构建了发夹型的SiRNA，连接到巨细胞病毒载体，然后转染缺氧培养的RPE细胞，发现该SiRNA可以减少PRE细胞表达VEGF。Cashman等[47]也进行了相似的研究，其用RNA干扰理论构建出发夹状RNA, 重组到腺病毒载体中,这种发夹状RNA能使RPE细胞表达VEGF出现基因沉默。目前未见VEGF特异性SiRNA应用于DR治疗的报道。

    4.6激酶抑制剂 一些针对VEGFR-1或VEGFR-2的小分子的激酶抑制剂如PTK787,SU11248,ZD6474也被发现有抑制VEGF生物学效应的作用，它们作为治疗新生血管的药物已进入临床实验阶段。这些药物并不是直接针对VEGF，而且一般用于癌症的治疗。其中SU11248(商品名Sunitinib)是多种受体激酶的抑制剂，已有SU11248用于治疗脉膜新生血管的动物实验[48]。

    4.7减少VEGF生成的药物 一些与VEGF调控有关的抑制眼底新生血管的方法也在研究过程中。如Konopatskaya等[49]对VEGF165b抑制眼底新生血管进行了探索，其将1ng的重组人VEGF165b注射到高氧诱导的视网膜病大鼠眼中，观察到视网膜新生血管区从23±3%下降到12±3.3%，正常血管区从（62±4）%上升到（74±4）%，表明单次剂量眼内注射VEGF165b可以抑制视网膜前的新生血管，而对视网膜内的正常血管没有影响，提示调整眼内VEGF的两类异构体的生成比例可以为治疗眼内新生血管疾病提供一种新的策略。HIF通过与VEGF基因的起动子结合增加VEGF转录，传递缺氧对VEGF的诱导作用，几种抑制HIF的小分子新药正在实验过程中，而且一些原有药物被发现有抑制HIF的作用,如2-benzoyl-phenoxy acetamide、那可丁（Noscapine），这些药物最终减少VEGF的生成。部分皮质激素类药物可以减少VEGF的分泌，减轻VEGF介导的炎症过程及新生血管，这些药物包括曲安奈德[50]、阿奈可他等。Kim等[51]研究发现曲安奈德通过阻断缺氧反应性的促炎基因的诱导激活进而下调VEGF的表达，从而发挥前述作用。SB-267268是一种α(v)β3和α(v)β5整合素的非蛋白拮抗剂，它可以减少早产儿视网膜病小鼠模型的视网膜表达VEGF和VEGFR-2，最终可以减少约50%的病理性新生血管，研究者认为SB-267268可能在其它类型的视网膜新生血管治疗中也发挥重要作用[52]。Neu等[53]发现Arg-Gln组成的二肽可以抑制小鼠的氧诱导视网膜病模型的视网膜新生血管，其通过体外实验研究发现Arg-Gln二肽对人PRE分泌VEGF有显著的抑制作用，并且效果与剂量相关，在体内实验中，与对照组Ala-Gly二肽相比，显著的抑制了视网膜组织VEGFmRNA的表达，抑制效果为（64±9）% (P <0.001)，与对照组相比每天按5g/kg的量注射Arg-Gln显著的抑制了视网膜前的（82±7）%的新生血管（P <0.05），提示此种二肽可能在治疗早产儿视网膜病中发挥作用。

    总之,VEGF及其受体在眼底新生血管的发生、发展中居于关键地位。一方面，DR、AMD等疾病引起VEGF及其受体表达增多；另一方面，表达上调的VEGF及其受体导致了眼底的微血管病变，主要包括血管通透性增高和血流量的变化、视网膜新生血管、脉络膜新生血管。随着人们对VEGF及其受体的认识的进一步深入，一些研究领域，如寻找VEGF及其受体表达的新的调控机制、抑制VEGF及其受体发挥生物效应等将具有更加重要的意义。

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