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DNA微阵列在肿瘤耐药研究中的应用及指导个体化治疗

2009-09-20 17:39:12 作者：新特药房来源：中国医药论坛报浏览次数：86 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。化疗是肿瘤治疗的有效手段之一，某些恶性肿瘤的化疗效果虽然有明显提高，但是化疗药物严重的毒副作用及治疗结果的不可预见性，一直是困扰临床医生的一个难 ...

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。化疗是肿瘤治疗的有效手段之一，某些恶性肿瘤的化疗效果虽然有明显提高，但是化疗药物严重的毒副作用及治疗结果的不可预见性，一直是困扰临床医生的一个难题。药物耐受是肿瘤化疗中常见的问题，肿瘤药物耐药有两种类型：其一为先天性耐药，即先前未经治疗的肿瘤细胞天生就对化疗药物不敏感；其二为后天获得性耐药，指经治疗的肿瘤细胞再次接受化疗药物后变得对药物不再敏感。目前，许多耐药研究小组都在研究肿瘤耐药发生的各种机制，希望能够克服化疗的主要障碍。研究人员发现获得性耐药是多因素引起的，涉及到宿主因素、肿瘤细胞先天和后天基因表达的变化等。决定化疗药物耐药性的基因，被称之为耐药基因，而能对肿瘤耐药细胞进行基因表达分析的技术逐渐引起人们的关注。
   DNA微阵列对人类基因的检测及指导临床治疗已成为当今科学领域的一个新热点，微阵列的出现为化疗药物基因表达的检测提供了一个新的工具。利用DNA微阵列技术可对癌症病人的基因谱进行分析，进而预测病人对肿瘤药物的反应及指导个体化用药。本文就DNA微阵列在肿瘤耐药研究中和指导个体化治疗的应用进行综述。
   1 DNA微阵列的介绍
   1.1 DNA微阵列的概述
   DNA微阵列(DNA microarray)，又称基因芯片(gene chips)或DNA芯片，属于生物芯片(biochip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等多门学科的高新技术，把大量基因探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵。1991年美国Afymet Rix公司的Fodor博士成功研制了世界上第一块芯片，之后斯坦福大学 Schena等在此基础上对芯片技术作了进一步的改进，第一次成功地应用此项技术对拟南芥的基因表达进行了分析，并将其微阵列点制的方式用于制备人类基因的芯片，于1995年10月在斯坦福公布了第一个人类基因芯片，随后在Science上发表文章讲述了芯片技术在基因表达监测中的应用，从此拉开了生物芯片技术研究与开发的帷幕。
   DNA微阵列分析的强大力量正在席卷医学领域，它用含有成千上万种DNA和蛋白序列的小型玻璃芯片取代了传统生物分析中所用的凝胶、滤器和纯化柱，这一基因表达分析技术将给医学带来一场技术上的革命。
   1.2 DNA微阵列的原理及制作
   DNA微阵列的原理：来自细胞、组织和其他来源的生物样品的mRNA经反转录后得到荧光染料标记的cDNA,然后与含有成千上万个基因的玻璃芯片进行杂交。荧光标记的cDNA与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，荧光信号的强度与基因表达的丰度成正相关，根据信号强度可了解样本中各种基因存在或者基因表达的情况。
   DNA微阵列的制作主要参照Schena的方法：首先将含有数千个基因的PCR产物——cDNAs、寡聚核苷酸等制成靶标并用点样仪分配到载玻片上制成DNA微阵列，然后将实验组和对照组的total RNA，和含有T7RNA聚合酶启动子序列的OligodT引物杂交，经反转录酶和杂交，有OligodT引物的mRNA合成出单链cDNA分子后，再合成出双链cDNA分子，最后利用双链cDNAs和T7RNA聚合酶扩增出大量的RNA（aRNAs）。将实验组和对照组的aRNA分别标记Cy5dCTP和Cy3dCTP荧光染料制成探针，共同杂交于微阵列上，然后冲洗、扫描，最后根据Cy5∶ Cy3的荧光信号强度来评价结果。
   2 DNA微阵列在常见化疗敏感肿瘤耐药研究中的应用
   2.1 DNA微阵列在乳腺癌化疗药物耐药研究中的应用
   乳腺癌是危害妇女健康的最常见的肿瘤，辅助化疗是乳腺癌的主要治疗方法之一，蒽环类（如阿霉素）、紫杉烷类（如紫杉醇）是乳腺癌治疗的两类一线药物，但这两类药物不仅价钱昂贵，而且肿瘤耐药的存在严重影响了化疗疗效。利用DNA微阵列检测出与化疗疗效相关的基因表达，对指导临床乳腺癌化疗方案的选择具有重要的意义。在对乳腺癌细胞MDAMB231进行DNA微阵列分析中，Mallory等发现了阿霉素耐药基因CAⅡ的存在。在随后的研究中Villeneuve等采用DNA微阵列技术比较野生型MCF7乳腺癌细胞与其同源的紫杉醇耐药细胞株(MCF7TAX)和阿霉素耐药细胞株(MCF7DOX)的基因表达，经微阵列分析及QPCR或免疫印迹证实后得出：与紫杉醇耐药相关的特异性基因标记有（+RDC1、+IFI-30、+FURIN、+BCL2、-S100P、-MCP、-CAV1），与阿霉素耐药相关的标记有（+ABCB1、+CRYAB、+TOMM20、+ZFP36L2、+MDH2、+FDFT1），其中“+”表示上调，“-”表示下调。由于上述基因标记是药物特异性的，因此可成为预测乳腺癌患者对蒽环类或紫杉烷类耐药的重要分子标记。
   内分泌治疗在乳腺癌治疗领域越来越受到重视，三苯氧胺被广泛用于乳腺癌的治疗。DNA微阵列对三苯氧胺耐药的检测能显著提高乳腺癌的疗效预测，减少不必要的毒副作用。在一项研究中采用DNA微阵列检测发现NFκB和AP1的转录表达水平的提高与雌激素受体阳性的乳腺癌患者对三苯氧胺的抵抗和耐药有关，用NFκB和AP1的阻断剂可以提高乳腺癌对三苯氧胺的敏感性。
   2.2 DNA微阵列在胃癌化疗药物耐药研究中的应用
   依立替康是胃癌化疗的主要药物，为了研究胃癌患者对依立替康的药物基因组学, Chun等对8位接受依立替康治疗前和治疗48h后的胃癌患者中腹膜或胸膜渗出液标本进行了DNA微阵列分析。通过对3位依立替康敏感者和5位耐药者比较，微阵列检测到5位耐药患者中MT1X呈现明显的过度表达，随后将转染了MT1X基因的胃癌细胞与正常对照组细胞进行MTT实验对比检测后发现：前者的依立替康半数致死剂量显著高于对照组，表明依立替康诱导MT1X的上调与胃癌患者对依替立康的耐药有关。
   为了揭示胃癌细胞对多种化疗药物耐药的机制，Kang等通过对4种不同的胃癌细胞株(SNU620，SNU638，SNU668， SNU719)重复给予5氟尿嘧啶（5-fluoro2,4pyrimidinedione，5-Fu）、阿霉素、顺铂3种药物，建立了10例耐药的胃癌细胞株。与对照组相比，微阵列从对5-Fu、阿霉素、顺铂3种药物耐药的胃癌细胞中检测到了8个对两种以上药物同时耐药的基因,其中MDK在胃癌耐药细胞中的表达最强，该研究提示MDK是胃癌细胞中产生多药耐药的重要基因。
   2.3 DNA微阵列在肺癌化疗药物耐药研究中的应用
吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，为了找到能预测吉非替尼疗效的基因标记，Kakiuchi等利用DNA微阵列检测吉非替尼敏感组和非敏感组两组病人的基因表达，发现有51个基因表达的水平明显不同，其中最为明显的是：非敏感组中AREG过度表达，而在敏感组AREG基因却并未表达，从而得出AREG与非小细胞性肺癌对吉非替尼的耐药有关。
   Davidson等利用DNA微阵列研究两种对吉西他滨耐药的非小细胞性肺癌细胞（H358G200和H460G400）发现，与正常来源的原始母细胞（H358和H460）相比：两种耐药细胞中RRM1表达显著升高，RTPCR与Western免疫印迹术也证实两种耐药细胞中RRM1的mRNA和蛋白质的水平增高，表明RRM1的高表达与吉西他滨治疗肺癌的耐药相关，RRM1也成为吉西他滨药物反应的生物学标记，为临床治疗提供重要的生物学信息。
   2.4 DNA微阵列在结肠癌化疗药物耐药研究中的应用
   某些基因的低表达也与肿瘤耐药存在相关性。在一项研究中，与敏感组细胞相比，经DNA微阵列检测到4种对5-Fu和依立替康等耐药的结肠癌细胞（MIP/5Fu、 MIP/CPT、MIP/ETO、MIP/CIS）中sparc基因表达水平明显降低（降低12.9倍），将sparc基因转染耐药细胞后再给予5-Fu治疗，结肠癌细胞死亡数明显增加，并且能够逆转其对5-Fu的耐药性。随后的在体实验中也证实sparc的高表达能增加裸鼠对5-Fu等化疗药物的敏感性且提高肿瘤的缓解率。sparc基因的低表达与结肠癌耐药呈正相关，且以sparc为基础的基因治疗能增加结肠癌对化疗药物的敏感性，为癌症的治疗提供了一个新的方法。
   Boyer等使用DNA微阵列分析了PDF，calretinin，SSAT 3个基因表达水平的失调在结肠癌化疗中的作用，研究显示：在使用5-Fu和奥沙利铂治疗的结肠癌患者中，上述3个基因的表达水平的变化与患者对5-Fu和奥沙利铂的耐药有关。
   2.5 DNA微阵列在胰腺癌化疗药物耐药研究中的应用
   吉西他滨是胰腺癌化疗的一线药物。为了探索胰腺癌细胞对吉西他滨产生耐药的原因以提高吉西他滨对胰腺癌的治疗效果，Akada等采用DNA微阵列技术发现Bcl2家族蛋白BNIP3的低表达与胰腺癌对吉西他滨的耐药有关。通过使用siRNA法对敏感组中BNIP3进行干扰，发现BNIP3表达下降使胰腺癌细胞对吉西他滨耐药增加。该研究得出：胰腺癌患者中BNIP3表达下降与对吉西他滨的内在化疗抵抗性呈正相关。在另一研究中利用DNA微阵列检测到对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中p8基因过度表达，以p8基因为阻断靶点可能成为提高吉西他滨疗效的新辅助疗法。
   2.6 DNA微阵列对多药耐药的研究
   在所有肿瘤耐药机制中多药耐药是一个不可忽视的关键环节，是肿瘤治疗失败的重要原因。ABC盒式运载体家族是多药耐药家族中重要的一员，包括ABCB1 (MDR1)、ABCC1(MRP1)以及ABCG2 (BCRP)等。为了更深入更全面的了解多药耐药，我们需要同时更深刻的了解ABC运载体家族的基因表达情况。Johnsson等用3种原生型的细胞株K562（慢性髓细胞性白血病细胞）、MCF7（乳腺癌细胞）、S1（结肠癌细胞）制备成对柔红霉素（DNR）、阿霉素（DOX）、依托铂苷（VP）、长春新碱（VCR）、环磷酰胺（MX）几种化疗药耐药的细胞。随后提取各耐药细胞的RNA与其相对应的原生型非耐药细胞对照组RNA同时杂交于微阵列上进行基因检测。结果分析表明：ABC运载体家族成员ABCB1（MDR1）基因在几种耐药细胞（KDNR、KVCR、KVP、MDOX）中均表达明显增高。另一常见的ABC运载体基因ABCG2（MXR/BCRP）在两种环磷酰胺（MX）耐药细胞（MMX、SMX）中表达显著增高，在另一MX耐药细胞KMX中也可发现ABCG2基因表达轻微上调。该实验利用微阵列技术证实了ABC运载体家族基因在多药耐药（MDR）中的重要作用。在不久前的一项研究中也进一步发现在1例对紫杉醇强烈耐药，同时对多西紫杉醇、阿霉素、长春新碱也产生交叉耐药的肺癌细胞株NCIH460/PTX250中MDR1/ABCB1基因高度表达（上调了1 092倍）。
   进一步研究ABC运载体基因在多药耐药中的作用将为临床对多药耐药的诊断以及指导治疗等开辟新的路径。
   3 DNA微阵列对肿瘤个体化治疗的指导
   DNA微阵列应用于临床肿瘤个体化治疗已成为一个新的发展趋势，在病人接受化疗药物前用DNA微阵列检测出肿瘤患者的基因表达，分析基因表达谱与药效之间的关系，预测药物反应及指导化用药，可减少并避免给病人带来不必要的毒副作用及经济负担。综上所述，已经有一系列的研究通过DNA微阵列技术检测到了与肿瘤化疗反应相关的基因分子标记的存在，如果能证明这些基因标记对化疗疗效的预测，那么推广DNA微阵列技术在临床的应用也即将迎来曙光。
   Potti等用微阵列检测出了一系列与TFAC（紫杉醇、5-Fu、阿霉素、环磷酰胺）化疗方案疗效相关的基因谱，为了证明这些基因谱是否有预测价值，Potti和同事们在前述研究的基础上进行了另一实验：以125名雌激素受体阴性的乳腺癌患者为实验对象，取病人的组织芯活检组织，随后将病人随机分为两组进行化学治疗：66位（28位pCR）接受FEC化疗方案（5-氟尿嘧啶、表柔比星、环磷酰胺），另59位（27位pCR）接受TET方案（多西紫杉醇、表柔比星、多西紫杉醇）治疗，化疗后对病人进行手术治疗，根据病理性完全缓解率（pCR）评价化疗敏感性。另一方面，提取组织RNA杂交于Aff ymetrix X3P芯片，以之前研究检测到的TFAC方案的药效相关基因标记为对照，检测125名患者的基因表达并评价与药效的关系。结果分析显示:FEC方案特定的基因标记的预测敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、准确性分别为96%、66%、68%、96%、79%。TET方案的特定标记的敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性分别为93%、69%、71%、92%、80%。该实验证实由微阵列检测到的TFAC方案的特定基因标记对乳腺癌化疗反应的预测具有较高的准确性，同时还指出两方案的NPV值均很高（>90%），可以指导早期发现对FEC及TET方案无效的患者，并尽早选择其他新的化疗方案。该实验为证明DNA微阵列应用于肿瘤化疗预测、指导个体化治疗的可行性提供了重要的依据。
   4 展望
   现在已进入后基因时代，DNA微阵列可同时检测成千上万个基因的表达，其检测到的关于诊断、预后和治疗反应的标记基因可给病人的个体化治疗提供重要的信息来源。在微阵列检测出某化疗药物耐药基因的存在后，可以此基因为分子靶点进行阻断，阻断后能显著提高该化疗药物的疗效。如将现今很热门的siRNA技术与DNA微阵列结合应用于肿瘤个体化治疗正受到研究工作者的广泛关注。
   在另一方面，DNA微阵列也存在着一些缺陷与不足，如：费用昂贵、需要大量的肿瘤标本及高质量的RNA等。尽管如此，在不久的将来随着应用需求的增加以及费用的下降，DNA微阵列这项技术会更加广泛和有效地应用于临床。