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肝细胞癌p53、bcl2蛋白及微血管密度的检测及意义

2010-04-28 19:48:35 作者：新特药房来源：互联网浏览次数：81 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的探讨肝细胞癌(HCC)组织中p53、bcl2蛋白的表达及其与HCC血管形成及临床病理的关系。方法应用免疫组织化学SP法,对石蜡包埋的50例HCC癌组织和10例正常肝组织(对照组)标本进行检测。结果( ...

关键字： 癌肝细胞原癌基因蛋白质cbcl2 新生血管化病理性免疫组织化学

【摘要】目的探讨肝细胞癌(HCC)组织中p53、bcl2蛋白的表达及其与HCC血管形成及临床病理的关系。方法应用免疫组织化学SP法,对石蜡包埋的50例HCC癌组织和10例正常肝组织(对照组)标本进行检测。结果(1)p53蛋白在HCC癌组织(28/50,56%)的表达显著高于癌旁肝组织和对照组(均为0,P<0.01),其中癌旁有肝硬化组(25/3,69.4%)显著高于癌旁无肝硬化组(3/14,21.4%,P<0.01)。bcl2在癌旁肝组织(62%)的表达高于HCC癌组织(24%,P<0.01)。微血管密度(MVD)在癌组织中高于癌旁及正常肝组织。(2)在HCC癌组织p53蛋白表达与HCC低分化及门静脉癌栓的形成呈正相关;MVD与HCC门静脉癌栓的形成呈正相关,且其值在p53阳性组或bcl2阳性组均明显高于阴性组。结论p53和bcl2对促进HCC新生血管形成有一定作用;p53和MVD对判断HCC患者预后有一定意义。

【关键词】癌肝细胞原癌基因蛋白质cbcl2 新生血管化病理性免疫组织化学

恶性肿瘤的发生、发展与新生血管的形成及细胞凋亡的异常密切相关,有研究认为肿瘤血管的生成与细胞凋亡之间存在一定的关系[1],而p53和bcl2基因在调节细胞凋亡过程中起着重要作用。笔者采用免疫组织化学法检测肝细胞癌(HCC)组织中bcl2蛋白和p53蛋白的表达以及微血管密度(MVD),分析它们与临床病理特征的关系,探讨bcl2和p53在HCC血管形成中的作用。

1材料与方法

1.1一般资料收集福建医科大学及其附属第一医院病理科19962003年50例HCC患者病理标本,男性33例,女性17例,中位年龄53岁(30~73岁)。50例HCC标本均带有癌旁肝组织,其中36例癌旁肝组织见肝硬化。合并镜下门静脉癌栓者32例(64%)。临床TNM分期按UICC标准,Ⅰ期2例,Ⅱ期19例,Ⅲ期25例,Ⅳ期4例。HCC分级按WHO标准,高分化7例,中分化18例,低分化25例。收集10例尸检的正常肝组织作为对照组。

1.2方法所有标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。鼠抗p53、bcl2、CD34单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司),超敏SP(鼠)试剂盒、液体DAB酶底物试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。石蜡切片经脱蜡水化后,滴加一抗前用高压法行抗原修复,用H2O2甲醇去除内源性生物素。常规SP法(步骤按试剂盒说明书进行),DAB显色,苏木精对比染色。以已知p53阳性的乳腺癌切片和已知bcl2阳性的扁桃体切片作阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3结果判定p53蛋白、bcl2 蛋白的表达按Shimizu半定量方法判定并进行评分,阳性强度:无着色为0,淡黄色1,棕黄色2,棕褐色3;阳性细胞数(面积):无着色为0,着色面积<1/3为1,1/3~2/3为2,>2/3为3,2项结果相加≥3为阳性[2]。MVD计数方法:按照Weidner方法,即先在低倍镜(×100)下全面观察切片,以肿瘤区内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞丛作为1个微血管计算,确定肿瘤内血管密度的最高区域,在高倍镜(×400)下任取该区域5个视野,计算MVD的平均数,作为该病例的MVD值[3]。

1.4统计学处理采用χ2检验、t检验,在SPSS 10.0软件下进行。

2结果

2.1p53、bcl2 蛋白的表达p53阳性定位于HCC癌组织细胞核内,阳性率为56%(28/50),其中癌旁有肝硬化者较无肝硬化者p53蛋白表达明显增高,分别为69.4％(25/36)和21.4%(3/14),P<0.01;多呈片状或弥漫分布,少数呈簇状分布,在肿瘤边缘表达较强(图1A),癌旁肝组织及正常肝组织均未见p53表达;bcl2阳性定位于HCC癌组织、癌旁肝组织的细胞质内,阳性率分别为24%(12/50)和62%(31/50),P<0.01;正常肝组织不表达。癌组织中阳性信号少,呈小灶性、碎点状散落于胞质中(图1B),癌旁组织中阳性细胞染色深,成簇状或大片状分布。

2.2CD34的表达和肿瘤MVDCD34阳性表达呈棕黄色,定位于血管内皮细胞的细胞质和/或细胞A:p53蛋白，阳性信号位于肿瘤细胞核内; B:bcl2蛋白, 阳性信号位于肿瘤膜,癌组织MVD为(40.3±8.8),着色血管常呈毛细血管状、血窦状和混合状(图1C),癌旁及正常肝组织仅见极少部分肝血窦和汇管区部分血管着色。

2.3p53、bcl2、MVD与肝细胞癌临床病理特征的关系p53蛋白与HCC分化程度的降低及门静脉癌栓的形成呈正相关;MVD与HCC门静脉癌栓的形成呈正相关;bcl2蛋白与HCC临床病理特征无明显关系(表1)。表1HCC癌组织中p53蛋白、bcl2蛋白及MVD的表达及其与临床病理特征的关系
2.4HCC癌组织中p53、bcl2表达与MVD的关系HCC癌组织中p53阳性者和阴性者MVD分别为(40.3±7.5)和(33.4±6.2),而bcl2阳性者和阴性者MVD分别为(42.6±6.8)和(34.8±5.8),无论是p53阳性还是bcl2阳性的MVD均显著高于阴性(P<0.01,t检验)。

2.5HCC癌组织中p53与bcl2表达的相关性HCC癌组织中p53的表达与bcl2的表达无关(表2)。

表2HCC癌组织中p53与bcl2表达的关系

Tab 2The correlation between the expression of p53 and bcl2 in HCCp53nbcl2+－+28820－22418表中数据为例数.

3讨论

3.1p53蛋白在肝细胞癌的表达及意义众所周知,p53基因的突变产物p53蛋白是一种肿瘤促进因子,它的积聚与HCC的增殖和进展密切相关,以免疫组织化学方法检测到的p53蛋白都是这种突变型产物。文献普遍认为p53蛋白仅表达在HCC癌组织,且表达率随病理分级的增加而递增,但与门静脉癌栓形成无关[45],朱波等则认为癌旁组织也有38.5%的表达率,与癌组织表达无差异[6]。本研究证实p53蛋白仅在HCC癌组织中表达,且发现阳性癌组织P53的表达率在合并癌旁肝硬变较无合并癌旁肝硬变高,并随肿瘤分化程度的降低及门静脉癌栓的形成而增高,提示p53基因的突变发生在肝癌启动阶段之后,肝硬变病变有助于p53突变的发生,p53蛋白表达情况在一定程度上反映了肝癌细胞的增殖及恶性程度;p53和肝细胞癌的预后可能有一定相关性,但尚需随访及进一步扩大样本进行深入探讨和证实。

3.2bcl2蛋白在HCC的表达及意义bcl2基因是一种抗凋亡基因,它可阻止各种因素引起的肿瘤细胞的凋亡,在许多肿瘤中均发现bcl2表达增高。但本研究bcl2蛋白在癌组织却较癌旁肝组织表达弱,且与HCC的病理分级、临床分期及有无门静脉癌栓形成无关,说明bcl2基因对HCC的发生、进展并不起决定作用,它并非HCC凋亡调控的唯一因素,HCC中应该还存在独立于bcl2的其他调控细胞凋亡的途径和因素。癌旁组织中bcl2表达率高达62%,提示bcl2基因在抑制癌旁肝细胞凋亡以维持部分HCC患者的肝功能方面起重要作用。HCC癌组织中p53的阳性表达与bcl2的阳性表达无关,说明肝细胞癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,二者并不存在协同作用。朱朝辉等也报道膀胱癌中bcl2与p53表达无关[7],马旭东等也在非霍奇金淋巴瘤中发现二者并不相关[8]。

3.3p53、bcl2与HCC血管形成的可能关系临床和动物实验都证明,如果没有新生血管供应营养,肿瘤直径在达到1~2 mm后将不再增大,新生血管的形成既为肿瘤的生长提供了营养,又为肿瘤的转移准备了有利的条件。本实验HCC MVD数值的增高与门静脉癌栓的正相关关系进一步验证了新生血管对HCC进展的促进作用。大量实验表明血管内皮细胞生长因子(VEGF)能刺激血管内皮细胞的增殖及微血管通透性的增加,对肿瘤血管的形成有重要作用。有研究认为bcl2基因和突变型p53基因通过上调VEGF的表达而促进血管生成,而VEGF也可通过促进bcl2表达,抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的凋亡,从而促进肿瘤的生长[911]。本研究显示,肝癌组织中无论是p53阳性表达组还是bcl2阳性表达组的MVD均明显高于阴性表达组,提示p53、bcl2对于促进HCC新生血管形成有较为重要的作用。探讨肝癌细胞凋亡与血管生成之间的关系可以加深对HCC生物学行为的了解。