摘要: 目的  探讨口腔鳞状细胞癌凋亡与肿瘤血管生成的关系。  方法  60例口腔鳞状细胞癌组织为恶性组,10例口腔良性肿瘤为良性组,10例正常人牙龈组织作为正常组,观察口腔鳞状细胞癌的凋亡指数(AI)与癌灶内微血管密度(IMVD)的关系。肿瘤癌灶内IMVD的检测采用CD34抗原SP免疫组织化学染色;凋亡检测采用DNA原位末端标记检测法(TUNEL法)。  结果  3组IMVD差别有统计学意义;TNM分期与IMVD有关;IMVD与口腔鳞状细胞癌的颈淋巴结转移有密切的关系。恶性组AI低于正常组及良性组(P<0.01),而正常组与良性组之间差别则无统计学意义(P>0.05)。TNM分期与AI有关;颈淋巴结转移与AI无明显相关。  结论  口腔鳞状细胞癌的IMVD不仅与肿瘤的TNM分期、分化程度、颈淋巴结转移有关,而且与其AI也有密切的关系。

　　关键词:  细胞凋亡; 新生血管化,病理性; 癌,鳞状细胞; 抗原,CD34; 口腔肿瘤

　　细胞凋亡是活体细胞独特的生物学特征,其调节的失衡是细胞癌变的分子机制之一。实体瘤组织中富有微血管网络,供给肿瘤细胞养分和氧气。肿瘤组织的血管生成是肿瘤赖以增殖和转移的重要条件之一。口腔鳞状细胞癌(鳞癌)的组织中血管丰富,其细胞凋亡与肿瘤血管生成之间可能有一定的关联。笔者探讨口腔鳞癌的凋亡与癌灶内微血管密度(intratumoral micrevessel density,IMVD)的关系,进而了解两者在肿瘤发生发展过程中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例选择  60例口腔鳞癌的组织切片标本为恶性组,男性38例,女性22例,年龄(45±6.5)岁(38~64岁)。其中舌癌20例,颊癌20例,口底癌10例,牙龈癌10例。按TNM临床分期,Ⅰ期7例,Ⅱ期15例,Ⅲ期23例,Ⅳ期15例。其中颈淋巴结转移者31例,无颈淋巴结转移者29例。按鳞癌病理分级法进行病理分级,其中高度分化的20例,中度分化的12例,低度分化的28例。另外选择10例口腔良性肿瘤为良性组,10例正常人牙龈组织作为正常组。

　　1.2  材料  单克隆CD34抗体SP试剂盒、原位细胞凋亡检测试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。

　　1.3  方法

　　1.3.1  IMVD检测  采用CD34抗原SP免疫组织化学染色,第一抗体选用单克隆CD34抗体,方法参照文献[1]。凋亡检测采用原位DNA缺口末端标记检测方法(TUNEL),方法参照文献[2]。

　　1.3.2  IMVD计算  任何与附近微血管肿瘤细胞以及其他结缔组织明显分离的褐染的内皮细胞或内皮细胞簇即为CD34阳性，均被认为是单个的微血管。于显微图象分析仪下进行测量,低倍镜下(×40)任意寻找3个区域,再分别于高倍镜下(×400)、面积为0.5024 mm2下依顺序测量每个区域的3个视野,共得出9个数据,取其平均值作为每个标本的血管密度(血管数目/mm2)。

　　1.3.3  凋亡指数(apoptosis index,AI)计算  每张切片选10个高倍视野进行计数,细胞呈蓝色染色为凋亡阳性细胞计算凋亡细胞数,按下列公式计算即为凋亡指数(AI):
   
　　AI=凋亡细胞数/(10×0.5024)mm2

　　1.4  统计学处理  方差分析，相关分析。

2  结果

　　2.1  CD34表达  恶性组可见血管内皮细胞质中CD34点状分布,呈褐色;正常组及良性组则仅见黏膜下少量微血管散在分布。恶性组的鳞癌组织中IMVD明显增多,集中分布于细胞增殖旺盛区域的间质内(图1)。

　　2.2  凋亡细胞表达  正常组凋亡细胞多分布于上皮的表层细胞层内,散在不均匀,呈蓝色;良性组除了在上皮的表皮细胞层有阳性细胞分布外,在棘细胞层内也有散在分布;而恶性组则多分布在癌巢中(图2)。

　　2.3  组织内IMVD及AI的比较  见表1。

　　图1  口腔鳞状细胞癌CD34阳性的肿瘤血管表达(SP染色  ×400)（略）

　　Fig 1  Immunohistochemical staining of CD34 in oral squamous cell carcinomas

　　图2  恶性组凋亡细胞在癌巢分布(TUNEL法  ×400)（略）

　　Fig 2  TUNEL staining from oral squamous cell carcinomas showed apoptotic cells in carcinoma lesion

　　表1  3组标本组织内癌灶内微血管密度及凋亡指数的比较（略）

　　Tab 1  The correlation of intratumoral micrevessel density and apoptosis index in three groups

　　与正常组比较,☆:P＜0.05； 与良性组比较，△：P＜0.05.

　　2.4  不同临床分期的IMVD及AI分布  见表2。

　　表2  不同临床分期的癌灶内微血管密度及凋亡指数分布（略）

　　Tab 2  IMVD and AI in different clinic stagesTNM

　　与Ⅰ期比较,☆:P＜0.05； 与Ⅱ期比较，△：P＜0.05.

　　2.5  颈淋巴结转移与IMVD及AI的关系  见表3。

　　表2  颈淋巴结转移与癌灶内微血管密度及凋亡指数的关系（略）

　　Tab 2  IMVD and AI in cervical lymphatic metastasis positive or negative

　　与阳性组比较,☆:P<0.05.

　　2.6  口腔鳞状细胞癌IMVD与AI的关系  将35例凋亡细胞阳性的口腔鳞状细胞癌病例的IMVD与其相应的AI绘制成散点图,显示两者呈反向相关的直线趋势(图3)。经统计学分析,相关系数及回归系数具有统计学意义(P<0.01)。相关系数:-0.8006(P<0.05)。直线回归方程:
   
　　Y=77.3303-0.1276X,r=0.7059,P<0.01

　　图3  口腔癌癌灶内微血管密度及凋亡指数关系（略）

　　Fig 3  The relation of IMVD and AI in oral cancer

　　3  讨论

　　3.1  本实验中恶性组的IMVD较正常组及良性组明显高,主要集中在肿瘤的周边区和癌灶基底细胞层邻近的间质内,癌灶内分布很少,表明肿瘤内新生血管丰富,随着口腔鳞状细胞癌TNM分期的发展,癌灶内的IMVD也随之增加,Ⅲ、Ⅳ期病例的IMVD比Ⅰ、Ⅱ期明显增多,由于Ⅲ、Ⅳ期口腔鳞状细胞癌的体积及浸润范围的扩大,为了维持肿瘤发展的营养需要,血管生长加快,提供肿瘤细胞氧气及营养。口腔鳞状细胞癌颈淋巴结转移病例的IMVD要高于无颈淋巴结转移病例,提示口腔鳞状细胞癌的IMVD的高低与颈淋巴结转移有关,IMVD高的口腔鳞状细胞癌可能易发生转移。肿瘤细胞要发生转移,首先要进入血管,并定居于靶器官的微血管结构内,在靶器官内增殖,诱发新生血管形成。Ⅲ、Ⅳ期的口腔鳞状细胞癌其癌灶的新生血管结构不成熟,易被肿瘤细胞穿透,进入血液循环。

　　3.2  本研究显示口腔鳞状细胞癌的IMVD与癌灶的AI呈负相关,IMVD表达高者其AI低,IMVD表达低者AI高,表明血管生成时肿瘤细胞的凋亡随着减少。当肿瘤血管发生时,由新生血管运送到肿瘤区的内皮细胞、巨噬细胞和宿主细胞等产生生长因子(如纤维细胞生长因子、肝素结合上皮生长因子等),并导致旁泌性作用[3],这些生长因子持续作用在肿瘤细胞上,剥夺了诱导成片细胞凋亡的能力,因此凋亡的抑制是肿瘤血管生成的结果之一。

　　3.3  在IMVD低的肿瘤组织中,因为IMVD较低,供氧少,肿瘤组织处于相对缺血缺氧的状态,在早期肿瘤组织可能通过提高肿瘤细胞的凋亡水平,减少组织对氧及营养的需求,以满足肿瘤组织对氧及血供的要求,同时缺氧可诱导血管内皮细胞生长因子的表达和血管生成。但随着肿瘤体积的增加,肿瘤中血管内皮细胞的营养供给减少,虽然IMVD表达较高,但实际增加的血管管径小,血流速度及流量的均值甚至不及IMVD表达低的肿瘤。肿瘤微循环相对不足且低效[4],这种不良的肿瘤生长环境可导致bcl2等凋亡抑制基因的激活[5],抑制肿瘤细胞的凋亡。因此IMVD表达较高的口腔鳞状细胞癌临床分期多在Ⅲ、Ⅳ期,凋亡指数低,而IMVD表达较低者则多集中在Ⅰ、Ⅱ期,凋亡指数较高。

参考文献：