【摘要】　目的　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸切口末端标记（TUNEL）法检测鼻咽癌患者不同剂量照射前后肿瘤细胞凋亡的变化，并初步探讨其潜在的临床意义。方法　 将接受根治性放射治疗的病理证实为鼻咽低分化鳞状细胞癌的25例患者分为5个组，每组5例。5个组分别在分割剂量1.9Gy/次照射1～5次后3～6h活检取鼻咽肿瘤组织。采用TUNEL免疫组织化学法检测鼻咽癌组织放射治疗前、后肿瘤细胞凋亡。结果　放射治疗前、后凋亡指数均数分别为0.44（0.10～1.15），0.51（0.05～1.40）（P＞0.05）。照射9.5Gy后的凋亡指数较放射治疗前明显增加（0.98对0.44，P=0.009）。凋亡指数＜0.35和≥0.35病例的无瘤生存率曲线差异无显著意义（P＞0.05）。影响无瘤生存率的单因素和多因素分析未显示出凋亡指数是独立的预后因素。结论　鼻咽癌常规分割照射9.5Gy后肿瘤细胞凋亡指数较放射治疗前显著增加。放射治疗前肿瘤细胞自发性凋亡水平未显示出独立的预后价值。

Prognostic significance of apoptosis prior to and after different doses of radiotherapy in nasopharyngeal carcinoma: preliminary report

BAI Yongrui　HE Shaoqin　QIU Xingxian　et al

　　Department of Radiation Oncology, Cancer Hospital,Shanghai Medical University，Shanghai 200032，China

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the changes of tumor cell apoptosis prior to and after different doses of radiotherapy in patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) and to determine whether the frequency of apoptosis was correlated with prognosis.　Methods　Twenty-five patients histologically proven to be nasopharyngeal squamous cell carcinoma were eligible to enter into this study. Patients were divided into 5 groups, 5 patients per group. Pretherapy biopsy and second biopsy from the nasopharyngeal tumor 3～6 hours after 1～5 fractions irradiation respectively (1.9Gy per fraction a day) were taken. Apoptotic cells were identified and quantified by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) method.　Results　The mean of apoptotic index prior to and after radiotherapy were 0.44 (range: 0.10～1.15) and 0.51 (range:0.05～1.40) respectively (P＞0.05). But the AI after 9.5Gy in 5 fractions was significantly higher than that of pretherapy (0.98 versus 0.44, P=0.009). The disease free survival curve for patients with a low AI (＜0.35) was not significantly different from that for those with a high AI (≥0.35), P＞0.05. Univariate and multivariate analysis indicated that the AI of pretherapy biopsy showed no prognostic value.　Conclusions　The tumor cell AI after doses of 9.5Gy in 5 fractions was higher than that of pretherapy for 25 patients with NPC in this study. Analysis with Cox regression models did not show the apoptotic index prior to treatment to be an independent prognostic factor.

　　【Key words】　Nasopharyngeal neoplasms / radiotherapy; Apoptosis

　　细胞凋亡(apoptosis)是在某些生理或病理条件下，细胞接受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的死亡过程。它不仅对胚胎发生、器官发育、变态作用及保持机体自我稳定等过程至关重要，而且在控制细胞增殖、肿瘤的发生和发展中起重要作用［1］。在肿瘤中，细胞凋亡可因基因突变(如p53等基因的突变)而受抑制，也可以因抗肿瘤措施如放射治疗及化学药物治疗而激活［2］。本研究采用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,

　　TdT）介导的脱氧核苷酸切口末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）法，首次检测不同剂量照射前、后鼻咽癌活检标本中肿瘤细胞凋亡的变化,并初步探讨其潜在的临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床资料：1996年10月至1998年7月间，25例病理均证实为鼻咽低分化鳞癌的患者接受了根治性放射治疗。其中男性14例，女性11例；年龄范围16～66岁，中位年龄43岁。鼻咽部采用60Co或6MV　X射线照射，常规分割组中位肿瘤剂量72.3Gy，照射38次，56d完成（70.3～76.5Gy，37～41次，51～58d），后程加速超分割组中位肿瘤剂量73.1Gy，照射43次，47d完成（70.6～80.1Gy，41～47次，44～56d）。中位随访时间492d（163～816d）；16例随访1年以上，6例随访2年以上。一般临床情况见表1。

因素	例数	因素	例数
年龄(岁)		N分期
≤43	12	N0	1
＞43	13	N1	7
性别		N2	16
男	14	N3	1
女	11	临床分期▲
T分期		Ⅱ	2
T1	2	Ⅲ	16
T2	13	Ⅳ	7
T3	4	分割方式
T4	6	常规分割	9
		后程加速超分割	16

表1　25例患者一般临床资料分布

注：▲：按1992年福州会议分期标准分期1.2　肿瘤标本：25例患者分5个组，每组5例。5个组病例分别在分割剂量为1.9Gy/次照射1～5次后3～6h活检取鼻咽肿瘤组织。将照射前和上述不同剂量照射后鼻咽活检组织常规石蜡包埋制片，HE染色用于常规病理诊断，TUNEL法染色用于凋亡观察。

　　1.3　凋亡细胞检测及计数：采用Oncor公司的Apop Tag in Situ Apoptosis Detection Kit（Catalog#：S7100-kit）。检测方法主要步骤是：将4μm厚切片经消化、阻断后，滴加TdT（1∶2）反应液，在37℃湿盒中孵育2h；终止反应后滴加抗地高辛过氧化物酶，室温孵育1h；显色后用质量浓度为50g/L的甲基绿复染［3］。计数用显微镜目镜附测量视野100网格（10×10 Grids），高倍镜下（×400）面积为625μm2。计数时对照HE染色片在TUNEL染色片上随机选取肿瘤区域，避开淋巴细胞浸润区和间质区；高倍镜下，计数区域按从上到下，从右到左的顺序计数；每个切片每次计数10个测量视野；凋亡指数（apoptotic index, AI）是指平均每个测量视野100网格中的凋亡细胞数；在不同时间计数2次，取平均值为每个标本的凋亡指数［4］。

　　1.4　统计方法:使用SPSS 7.5统计分析软件。放射治疗前、后肿瘤细胞AI比较用配对t检验，放射治疗前及放射治疗后5个剂量组之间AI的比较采用方差分析。用Kaplan-Meier法计算无瘤生存率并绘制曲线、Logrank法检验生存曲线差异。采用Cox比例风险模型进行预后因素分析。

　　2　结果

　　2.1　肿瘤凋亡细胞特征：TUNEL方法染色后，凋亡细胞核染呈深棕黄色（图1）并有如下特征：凋亡细胞散在分布，常常呈单个圆形细胞，体积缩小，有时形状扭曲，周围常有清晰空晕；染色质浓缩凝聚，为深棕黄色，紧贴核膜内面呈新月形或戒指状或呈固缩状；有时胞核裂解成凋亡小体。非凋亡细胞大多数染色阴性，呈淡绿色。有少部分非凋亡肿瘤细胞染成淡黄色，但与凋亡细胞能明显相区别。所有的切片均有凋亡细胞，只是数目不等。1例放射治疗前、6例放射治疗后切片仅见少量散在的癌细胞，未得出凋亡指数，统计时以缺省值处理。

图1　 TUNEL免疫组化染色，甲基绿复染后的凋亡细胞

　　2.2　凋亡指数比较：放射治疗前、后标本中肿瘤细胞AI均数分别为0.44，0.51（P＞0.05），AI值范围见表2。放射治疗前及5个剂量组放射治疗后肿瘤AI指数分布箱图见图2。组间方差分析的结果显示放射治疗9.5Gy后AI值比放射治疗前高（P=0.009）。
图2　放射治疗前及不同剂量照射后AI值分布箱图

剂量组(Gy)	均值	标准差	范　围
0.0	0.44	0.33	0.10～1.15
1.9	0.17	0.08	0.05～0.25
3.8	0.47	0.25	0.30～0.75
5.7	0.55	0.51	0.10～1.20
7.6	0.55	0.25	0.25～0.85
9.5	0.98	0.37	0.70～1.40

表2　放射治疗前及各剂量组的AI值

2.3　放射治疗前肿瘤细胞AI值与鼻咽癌患者预后的关系：末次随访时，患者鼻咽原发灶全部控制，颈部复发行挽救手术的2例仍生存，4例远地转移中死亡1例。放射治疗前标本肿瘤细胞AI中位值是0.35，AI≥0.35（13例）和＜0.35（11例）的无瘤生存曲线见图3，二者差异无显著意义（P＜0.05）。

图3　AI≥0.35和AI＜0.35的无瘤生存曲线

　　将年龄、性别、分期、放射治疗分割方式以及AI≥0.35和＜0.35两个亚变量纳入影响无瘤生存率预后因素分析模型，单因素和多因素分析结果未显示凋亡指数具有独立的预后价值，详见表3。

表3　影响无瘤生存率的单因素和多因素分析结果

变量	单因素分析			多因素分析
	回归 　　系数	P值	相对 　　危险度	回归 　　系数	P值	相对 　　危险度
年龄	-0.0585	0.0940	0.9431	-0.1430	0.0714	0.8668
性别	0.2221	0.7869	1.2487	-2.1496	0.2667	0.1165
临床分期	0.3614	0.6081	1.4353	-2.2695	0.2589	0.1034
T分期	-0.0121	0.9770	0.9880	1.2699	0.3791	3.5604
N分期	0.9026	0.2232	2.4660	2.4780	0.1380	11.9175
分割方式	-1.6213	0.0663	0.1976	-3.9081	0.0595	0.0201
凋亡指数	0.0515	0.9498	1.0528	-0.3717	0.7667	0.6896

3　讨论　　细胞凋亡或称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，从形态学、生化及分子事件等方面与细胞坏死有明显的区别。凋亡虽然不是最重要的放射杀伤细胞方式，但放射后发生的细胞凋亡可能也起很重要的作用。本研究首次报道鼻咽癌患者放射治疗前和一定剂量照射后肿瘤细胞凋亡指数的自身对照观察，并初步探讨治疗前标本中肿瘤细胞凋亡水平在无瘤生存率预后因素中的地位。由于肿瘤组织少，故采用TUNEL方法检测放射治疗前和常规分割剂量照射后鼻咽癌活检组织中肿瘤细胞凋亡的水平。

　　鼻咽癌组织的凋亡，可在光镜下根据其染色质形态特征确定并计数［5］。但由于鼻咽癌组织HE染色片中肿瘤细胞重叠、异型大、多核畸形以及肿瘤细胞间淋巴细胞浸润明显，且淋巴细胞浆少核深染，易造成判断困难并带有主观性。TUNEL法特异性和敏感性较高，适用于单个细胞DNA小片段检测(比如石蜡包埋切片组织或培养细胞中凋亡细胞的核断裂片段检测)。本研究采用TdT将地高辛标记的核苷酸残基结合到细胞核内DNA3'—OH末端，标记靶特异地位于细胞核和凋亡小体上。TUNEL检测的阳性细胞呈深棕黄色，形态呈典型的凋亡细胞形态学特征［1］。

　　虽然放射杀灭肿瘤细胞效应中以增殖性死亡为主，但放射诱导肿瘤细胞发生凋亡可能占一定比例。放射后细胞发生的凋亡有3种形式：⑴在细胞分裂之前的细胞凋亡；⑵细胞分裂之后的细胞凋亡，但不要求有染色体畸变；⑶细胞分裂之后的只在有染色体畸变的细胞中发生的细胞凋亡［6］。离体细胞培养实验中观察的凋亡细胞可持续存在数小时，而在体的凋亡细胞产生后，可迅速被附近的吞噬细胞等摄取并很快被清除［7］。罗天锡等［8］电镜观察鼻咽癌患者放射治疗前肿瘤组织细胞发现凋亡及碎裂小体常被周围的癌细胞所吞噬。本研究观察到放射治疗后凋亡指数总体均数较放射治疗前高，但差异无显著意义（P＞0.05），原因之一可能是放射诱导的细胞凋亡一部分被吞噬细胞所清除。从总体趋势来看，分割照射1.9Gy/次，1次/d，在1.9～9.5Gy剂量范围内，肿瘤细胞AI值有增加的趋势。其中9.5Gy后的AI值较照射前明显增加，差异有显著意义（P=0.009）。Niible等［9］报道子宫颈癌9Gy分5次照射后，肿瘤细胞AI值由放射治疗前的0.27显著提高到1.20（P＜0.01）。由于离体鼻咽癌细胞株照射后可有较长的观察时间，因此可观察到照射后凋亡增加程度与单次照射剂量大小、分割照射和照射后孵育时间长短有明显相关性［10,11］。

　　肿瘤细胞AI值与患者预后关系的研究主要在子宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌及肺癌等。Levine等［12］报道宫颈癌细胞AI值是肿瘤局控和生存率的预后因素，AI≥0.48（中位数）的病例5年生存率为61%，AI＜0.48的病例5年生存率为79%。Tsang等［13,14］报道随着宫颈癌体积增大，AI值有增加的趋势，且与肿瘤增殖成正相关。但进入多因素分析时，只有当肿瘤直径＜6cm时，AI值高，无瘤生存率差。前列腺癌和膀胱癌的资料也显示AI值低，局部控制率高［4,15］。但子宫颈腺癌和乳腺癌的研究结果却显示AI值高，生存率好［16.17］。本研究结果显示AI值小于中位数病例的无瘤生存率稍好于大于中位数病例，但差异无显著意义。鼻咽癌患者放射治疗前AI值的单因素和多因素分析，未显示其是无瘤生存率独立的预后因素。最可能的原因是本组病例总数少（因为不同剂量照射后鼻咽肿瘤组织活检均须获得患者同意），另外与随访时间短以及病例分期范围较宽(Ⅱ～Ⅳ期)相关。目前观点认为凋亡是放射诱导细胞死亡的重要组成部分，但其在放射后肿瘤杀灭效应中的贡献尚存争论。鼻咽癌对放射治疗中度敏感，鼻咽癌细胞凋亡与放射敏感性之间的关系有待进一步研究探索。

(本文图1见对封2页)

　　基金项目：卫生部临床学科重点项目基金资助项目（97030222）

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