【摘要】　目的　以人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤模型，研究5-氟胞嘧啶(5-FC)作为原药对表达胞嘧啶脱氨酶(CD)的肾母细胞瘤治疗(以下简称CD/5-FC)的作用。方法　1例低分化肾母细胞瘤组织，移植于无胸腺BALB/c裸鼠，经连续传代，建立了人肾母细胞瘤异种移植瘤模型。以腺病毒为载体，分别建立CD基因(Ad/CMV-CD)和lac基因(Ad/CMV-lac)的表达载体。瘤内注射基因表达载体，使基因转导入肿瘤细胞。用RT-PCR检测转导基因在瘤细胞内的表达。腹腔注射5-FC，500 mg·kg-1.d-1，连续10 d，观察移植瘤生长情况。结果　经5-FC治疗的小鼠，表达lac基因的移植瘤生长情况与未转导基因的移植瘤并无两样；表达CD基因的移植瘤生长则受到显著抑制。根据接种肿瘤后8周的肿瘤重量，5-FC治疗对CD基因转导的移植瘤生长抑制率为65%。病理检查可见瘤细胞坏死，细胞器出现空泡。结论　在瘤内转导CD基因的基础上施以5-FC治疗，对人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤有明显疗效。

Therapeutic effect of 5-fluorocytosine on cytosine deaminase gene transduced Wilms′ tumor xenograft in nude miceBI Yunli, GAO Jiechun, XU Dehua.(Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
【Abstract】　Objective　To study the effect of 5-fluorocytosine (5-FC) as prodrug in the treatment of Wilms′ tumor xenografts transduced with cytosine deaminase (CD) gene.Methods　An in vivo model of a poorly differentiated Wilms′ tumor transplanted in nude mice was established. Expression adenoviral vector of CD gene (Ad/CMV-CD) or lac gene (Ad/CMV-lac) was transduced to the tumor xenografts by intratumoral injections. Expression of the transduced genes were confirmed by RT-PCR. Mice with Wilms′ tumor xenograft were treated with 5-FC (500 mg·kg-1.d-1×10d). Tumor growth was monitored.Results　The growth of tumor xenografts transduced with lac gene grew as quick as the untransduced ones. In contrast, the growth of the tumor xenografts transduced with CD gene was significantly inhibited as compared to untransduced and lac gene transduced xenografts. The average rate of inhibition was 65% according to the tumor weight at 8 wk. Cell necrosis was observed in the CD gene transduced tumors.Conclusion　Intratumoral cytosine deaminase gene transduction followed by systemic 5-fluorocytosine is effective in the treatment of Wilms′ tumor.
【Subject words】　Wilms′ tumor/drug therapy; 5-fluorocytosine; Cytosine deaminase; CD gene

　　肾母细胞瘤是小儿最常见的恶性肿瘤之一，目前肾母细胞瘤的治疗仍以手术、化疗和放疗为主，虽然总生存率达80%［1］以上，但部分预后不良型病例疗效仍不理想。我们以人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤模型，研究5-氟胞嘧啶(5-FC)作为原药对表达胞嘧啶脱氨酸(CD)的肾母细胞瘤治疗(以下简称CD/5-FC)的作用，现将结果报告如下。

　　材料与方法

　　一、转基因载体的制作

　　将pBluescript/CD中的CD基因通过酶切克隆入pAdE1CMV，得到pAdE1CMV/CD；以磷酸钙共沉淀法将pAdE1CMV/CD和pJM17共转入293细胞；以1个细胞中的噬斑纯化病毒，在293细胞中扩增、纯化并滴定病毒浓度，得到含Ad/CMV-CD的上清液，-80℃保存；同法制备Ad/CMV-lac病毒颗粒，-80℃保存。

　　二、CD基因RNA检测

　　1.病毒载体肿瘤内注射：以1例低分化间变型肾母细胞瘤标本，移植于BLAB/c雄性裸小鼠右前肢皮下，连续传代，建立Ball/c裸鼠移植瘤实验模型。当移植瘤直径达3～5 mm时，以108病毒载体肿瘤内多点注射，注射后分别于第1，3，5，7，9，11天处死裸鼠，取出肿瘤，-80℃保存。

　　2.RNA抽提：取100 mg的肿瘤组织、心脏、肺及肿瘤周围组织，以TRIzol液提取RNA。

　　3.RT-PCR：取mRNA 1 μl，加逆转录酶1 U，在0.5 ml离心管中，42℃水浴30 min，然后依次加入水39 μl、Buffer 5 μl、dNTP 5 μl、3′及5′端CD基因引物各1 μl(5′ATAGAATTCAGGCTAACAATGTCGAATAACG-CTT3′，5′TATGGATCCTCAACGTTTCTAATCGATGGC-TT3′)，于95～100℃水浴中预变性10～15 min，加入Taq酶，混匀，瞬时离心。PCR条件：变性90～95℃ 45 s，退火55～58℃ 45 s，延伸70～72℃ 45 s，最后延伸10 min。紫外光检测扩增条带并拍照。

　　三、实验分组及给药

　　将肿瘤体积较均一的14只荷瘤鼠，于接种第8周时随机分成3组：实验组(5只)、对照组1(4只)、对照组2(5只)。测量肿瘤最大径a及横径b，按公式V=π/6×a×b2计算3组平均体积，进行t检验。

　　实验组以Ad/CMV-CD 108加PBS至50 μl，于第1，3天肿瘤内注射，50 μl微量注射器多点注射；第3天开始以5-FC腹腔内注射(500 mg/kg)，连用10天。对照组1以Ad/CMV-lac(不含CD基因)108加PBS至50 μl，于第1，3天肿瘤内注射，50 μl微量注射器多点注射；第3天开始以5-FC腹腔内注射(500 mg/kg)，连用10天。对照组2为空白对照，不进行任何干预。

　　四、疗效观察

　　1.肿瘤生长情况：5-FC注射第7天起，盲法定人、定时(每周1次，共8周)测量肿瘤大小，当肿瘤直径达3 mm时，应用游标卡尺测量肿瘤的最大径a及横径b，按公式V=π/6×a×b2计算肿瘤体积，绘制生长曲线。第8周颈椎脱臼法处死裸鼠，称取裸鼠及肿瘤重量，进行方差分析。按公式(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)×100%求出抑瘤率。

　　2.病理及超微结构观察：肿瘤组织常规病理切片，HE染色，样品同时用2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定，缓冲液冲洗再固定于1% OSO4中，脱水后超薄切片，枸橼酸铅、醋酸铀双重染色，JEM 1200透射电镜观察。

　　3.图像分析仪检测DNA含量及细胞时相：肿瘤标本2～3 μm切片，分别行HE和Agure染色。采用图像分析仪测定50～100个细胞核，以同张切片间质淋巴细胞核DNA含量均数作二倍体对照，直方图形式打印输出DNA指数(DI)和A区域(G0和G1时相细胞)、B区域(S时相细胞)、C区域(G2和M时相细胞)的百分数。

　　结果

　　RT-PCR显示注射病毒载体后肿瘤内可检测到CD基因的表达，而周围肌肉组织及心、肺无转染基因的表达，PCR产物约12 kb(图1)。

1　CD基因RT-PCR电泳条带

1：心肌；2：肺；3：肌肉组织；4：肿瘤

1　CD基因RT-PCR电泳条带

　　两组对照组肿瘤生长均符合Gompertz模型，而实验组肿瘤生长明显受到抑制(图2)。根据本肿瘤生长模型，在接种8周左右肿瘤生长进入平台期，以此作为实验终点，处死裸鼠，进一步检查。实验组瘤重在1～3 g之间，平均(2.56±0.39) g；而对照组1瘤重达6～9 g，平均(7.22±1.1) g；对照组2瘤重达5～10 g，平均(7.4±1.4) g。实验组较对照组瘤重明显减少(P＜0.05)。对照组1的抑瘤率为64.6%，对照组2的抑瘤率为65.4%。

图2　实验各组肿瘤体积增长曲线

　病理观察结果可见治疗组出现大片肿瘤细胞坏死，无明显炎性细胞浸润，可见较多向间叶组织分化的细胞。而两组对照组与原移植瘤的病理表现相同，肿瘤增殖明显，生长活跃。

　　各实验组超微结构显示，治疗组肿瘤细胞线粒体明显肿胀，空泡化，核糖体较对照组明显减少，出现较多溶酶体，细丝样结构较治疗前增加；对照组无上述改变。

　　图像分析结果提示，各组肿瘤DNA指数基本相同，实验组G0+G1时相细胞(55.3%)较对照组1(35.6%)和对照组2(6.7%)增高，而G2+M时相细胞(4.4%)较对照组1(15.2%)和对照组2(27.5%)明显下降，细胞增殖活性亦似有所下降。

　　讨论

　　随着肿瘤综合治疗的运用，小儿恶性肿瘤的生存率大大提高，肾母细胞瘤的5年生存率从70年代初的58%上升到80年代的75%［2］。但综合治疗的副效应不容忽略，如：一些化疗药物除了常见的胃肠道反应、骨髓抑制外还有肾毒性；接受放疗的患儿常常出现下胸廓的畸形，女孩的第二性征的发育异常［2］；部分晚期和组织预后不良的病例治愈率仍然很低，即便侥幸生存，亦往往遗留严重的后遗症，生活质量大大下降。基因治疗目前虽还处于起步阶段，但从1990年Rosenberg等［3］以neo基因转导肿瘤致敏性淋巴细胞进行肿瘤标记以来，进展迅速，肿瘤基因治疗已越来越接近临床［4］。目前临床试验方案中，使用相对较多的酶-药物前体治疗，直接在肿瘤细胞内产生毒性物质，理论上这一方法能在更彻底有效地杀灭肿瘤细胞的同时，对周围正常组织不产生伤害，具有传统治疗所没有的优越性。

　　本研究采用的治疗方案为“自杀基因”治疗，即酶-药物前体治疗，通过腺病毒载体对肿瘤细胞转染CD基因，转化5-FC成为5-Fu。文献报道，裸鼠活体试验仅1%肿瘤细胞转染，即可达到杀灭肿瘤的效果［5］，其感染力强，故无需体外细胞培养，可直接进行基因转导，使用方便，是目前肿瘤基因治疗的良好工具。转染时必须使被感染细胞分布均一。预试验阶段我们曾行单次给药，但效果不佳；后在实验中采用多点多次注射，以增加转染细胞的比例及分布，使旁效应产生作用。本研究通过RT-PCR检测CD基因的表达阳性，证实CD基因转染有效，可用于肿瘤基因治疗的研究。

　　本实验证实，治疗组较对照组肿瘤缩小50%以上，实验组与对照组肿瘤生长差异有显著性，与国外文献报道相符［6］。腺病毒有溶细胞作用，高滴度的腺病毒颗粒亦可暂时性延缓肿瘤的生长。我们预试验阶段曾以108，109，1010病毒进行肿瘤内感染，均未发现病毒对肿瘤生长有影响；实验中以108进行感染，结果对照组未显示病毒本身的溶细胞作用。腺病毒可感染人类各种细胞［7］，我们使用的CMV启动子是万能强效启动子，如有周围正常组织的感染，转录合成腺苷酸脱胺酶可造成周围组织器官的损害。本实验过程中各组裸鼠的一般情况良好，RT-PCR检测转导基因在相邻组织及肺等器官中无表达。

　　腺病毒颗粒具有较强的免疫原性，表达基因产物的细胞可很快为人体免疫细胞所清除，尤其近来有实验表明，自杀基因治疗过程中的旁效应与宿主的免疫机制有密切关系［8］，故人体的免疫机制将显著影响疗效。本实验虽未发现病毒颗粒对周围正常组织的感染，但有报道存在这种现象。

　　本研究应用肾母细胞瘤裸鼠移植瘤模型，以腺病毒载体对肾母细胞瘤对活体肿瘤进行直接基因转导，以CD/5-FC系统进行疗效观察，证实具有明显的治疗效果和应用价值，希望以此推动国内小儿肿瘤基因治疗研究的不断深入。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570724)

　　参考文献：

　　［1］　Pizzo PA, Toplack DJ. Principals of pediatric oncology. 3rd ed. New York: Lippincott-Raven Press, 1997.733-760.

　　［2］　Alan WC, Andrew DJ. Three decades of chemotherapy for childhood cancer: from cure `at any cost' to cure `at least cost'. Cancer Surv, 1989,8：605-629.

　　［3］　Rosenberg SA, Aebersold P, Cometta K, et al. Gene transfer into humans: immunotherapy of patients with advanced melanoma using tumor infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. New Eng J Med, 1990,323：570-578.

　　［4］　Dube ID, Courmoyer D. Gene therapy: here to stay. Can Med Assoc J, 1995,152：1605-1613.

　　［5］　Huber BE, Austin AE, Richards CA, et al. Metablism of 5-flurocytosine to 5-flurouracil in human colorectal tumor cells transduced with the cytosine deaminase gene: significant antitumor effects when only a small percentage of tumor cells express cytosine deaminase. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91：8302-8306.

　　［6］　Hirschowitz AE, Ohwada A, Pascal W, et al. In vivo adenovirus-mediated gene transfer of the Escherichia coli cytosine deaminase gene to human colon carcinoma-derived tumors induced chemosensitivity to 5-fluorocytosine. Hum Gene Therapy, 1995,6：1055-1063.

　　［7］　Stratford-Perricaudet LD, Levrero M, Chasse JF, et al. Evaluation of the transfer and expression in mice of an enzyme-encoding gene using a human adenovirus vector. Hum Gene Therapy, 1990,1：241-256.

　　［8］　Hall SJ, Mutchnik SE, Chen SH, et al. Adenovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene and ganciclovir therapy leads to systemic activity against spontaneous and induced metastasis in an orthotopic mouse model of prostate cancer. Int J Cancer, 1997,70：183-187.